陳靜，陳志宏，張汆*，張玉龍

(1.滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與環(huán)境工程系，安徽 滁州 239000；2.滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，又稱為山椒，蕓香科植物，是一種重要的香辛料，具有增香去腥的作用，在食品加工中應(yīng)用廣泛[1]?；ń分泻谢ń窊]發(fā)油、生物堿、黃酮、植物甾醇、多糖以及維生素等多種生物活性物質(zhì)，有一定的防腐抑菌、抗氧化、提高免疫力、抗感染、抗?jié)?、抗腫瘤等功效[2-4]?；ń房煞譃榍嘟泛图t椒2種，青椒多產(chǎn)自南方，而紅椒在北方居多。2種花椒不僅在外觀上有較大差異，在風(fēng)味和組分方面也有一定差別[5]。

花椒中富含各種揮發(fā)油、黃酮和多酚等生理活性組分，對(duì)這些組分的分離提取也是目前研究的主要內(nèi)容之一。花椒中提取的揮發(fā)油對(duì)3種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)都表現(xiàn)出抑制作用，顯示出一定的體外抗腫瘤活性[6]。此外，花椒揮發(fā)油對(duì)人HePG2肝癌細(xì)胞也具有一定的殺傷力[7]。不同溶劑提取的花椒精油在顏色和氣味等方面有明顯差異，乙醚提取精油表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性[8]。宋麗雅等[9]研究發(fā)現(xiàn)花椒中提取的有效成分對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等微生物均表現(xiàn)出較好的抑菌活性。狄科等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用丙酮提取的花椒多酚具有較好的DPPH·清除能力。花椒水提物可有效抑制小鼠胃潰瘍，醚提物對(duì)鹽酸性大鼠胃潰瘍的形成有一定抑制作用[11]。

以青、紅花椒為研究對(duì)象，分別采用水、50%乙醇和無(wú)水乙醇作為提取溶劑制備花椒提取物，對(duì)這2種花椒提取物的體外抗氧化性質(zhì)進(jìn)行了分析和比較，通過(guò)研究，為花椒作為肉制品天然保鮮劑的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 材料

青花椒(藤椒)、紅花椒(漢源)：均購(gòu)于四川。2種花椒樣品經(jīng)干燥后粉碎(過(guò)40目篩)，即得青花椒粉和紅花椒粉。

1.1.2 儀器設(shè)備

中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-10B真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；721E型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

鐵氰化鉀、三氯化鐵(CR)、亞油酸、抗壞血酸、吐溫-20(CR)、硫氰酸銨、無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉等試劑：均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑公司；DPPH·(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，1,1-Dipheny1-2-Picrylhydrazyl Free Radical)：純度>97.0%，購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒提取物制備

無(wú)水乙醇提取物(簡(jiǎn)稱為E-100)的制備：分別稱取20 g青、紅花椒粉于燒杯中，加入100 mL無(wú)水乙醇溶解，超聲波輔助浸提30 min后抽濾，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇重復(fù)提取1次，合并提取液，真空濃縮后冷凍干燥，即得花椒無(wú)水乙醇提取物。

50%乙醇提取物(簡(jiǎn)稱為E-50)的制備：于乙醇提取后的殘?jiān)屑尤?00 mL 50%乙醇水溶液，重復(fù)上述提取流程，所得提取液濃縮后冷凍干燥，即得花椒50%乙醇提取物。

水提取物(簡(jiǎn)稱為E-W)的制備：50%乙醇水溶液提取后的殘?jiān)屑尤?00 mL水，重復(fù)上述提取流程，所得提取液濃縮后冷凍干燥，即得花椒水提取物[12]。

1.2.2 總還原力的測(cè)定

將花椒提取物分別配制成0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL的溶液。準(zhǔn)確吸取各溶液2.5 mL于試管內(nèi)，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴保溫20 min后迅速冷卻，之后再加2.5 mL 10%醋酸溶液，3000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，于700 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。按照上述方法同時(shí)測(cè)定不同濃度的抗壞血酸(VC)溶液總還原力[13，14]。不同濃度下VC溶液總還原力的測(cè)定同上。

1.2.3 DPPH·清除能力的測(cè)定

將花椒提取物分別配制成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的溶液。取2支試管，1支加1.0 mL0.2 mmol/L DPPH·-乙醇溶液，另1支加1.0 mL0.2 mmol/L DPPH·-乙醇溶液和0.2 mL樣品溶液，用無(wú)水乙醇定容至5.0 mL。室溫避光靜置30 min后在517 nm處測(cè)定吸光值，分別記作A0和A1，各樣品平行測(cè)定3次后取平均值[15-17]。樣品溶液的DPPH·清除率計(jì)算公式為：

清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

不同濃度下VC溶液DPPH·清除能力的測(cè)定同上。

1.2.4 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力測(cè)定

將花椒提取物分別配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的溶液。準(zhǔn)確吸取0.5 mL溶液，與2.5 mL亞油酸乳化液混勻，暗處于37 ℃水浴內(nèi)保溫24 h，反應(yīng)后得氧化液。取氧化液0.1 mL，加0.9 mL去離子水，依次加5 mL 75%甲醇溶液，1.0 mL 30%硫氰酸銨溶液和0.02 mol/L硫酸亞鐵溶液，靜置5 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)1。以蒸餾水代替樣品同方法測(cè)定吸光值A(chǔ)0[18]。

樣品溶液脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率計(jì)算公式：

IR(%)=(1-A1/A0)×100。

式中：IR為抑制率，%；A1為樣品溶液吸光值；A0為對(duì)照溶液吸光值。

不同濃度下VC溶液脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力測(cè)定同上。

1.2.5 不同時(shí)間條件下樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性研究

取脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力較強(qiáng)的樣品配制成1.0 mg/mL樣品溶液，按照上述方法分別測(cè)定反應(yīng)4，8，12，24，26，28，29，30 h時(shí)的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率，研究不同時(shí)間條件下樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性[19]。

1.2.6 對(duì)NO2-的清除作用

將花椒提取物分別配制成0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL的樣品溶液。準(zhǔn)確吸取5 μg/mL NaNO2溶液2 mL于50 mL容量瓶中，加5 mL樣品溶液反應(yīng)10 min，再加入2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置4 min，加1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，用蒸餾水定容至50 mL，靜置15 min后于538 nm處測(cè)吸光度值[20]，為A1。以蒸餾水代替樣品同樣方法測(cè)定吸光值得A0。

樣品溶液對(duì)NO2-的清除率計(jì)算公式為：

清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

式中：A1為加入樣品溶液時(shí)的吸光度值；A0為空白溶液的吸光度值。

不同濃度下VC溶液NO2-的清除率測(cè)定同上。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法

所有樣品均重復(fù)測(cè)定3次，最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 青、紅花椒提取物感官特性

6種青、紅花椒提取物的感官性狀見(jiàn)表1。青、紅花椒無(wú)水乙醇提取物帶有花椒特有風(fēng)味且顏色較深，呈粘稠狀。相比之下，其他2種提取物均為粉末狀，50%乙醇提取物的顏色和氣味要比水提取物更濃。原因可能與花椒中特征風(fēng)味物質(zhì)和色素多為脂溶性成分而易溶于乙醇有關(guān)。

表1 青、紅花椒提取物感官特性Table 1 The sensory properties of green and red peppers' extracts

2.2 總還原能力

總還原力是物質(zhì)體外抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)，主要通過(guò)檢驗(yàn)樣品是否為很好的電子供體，且其供應(yīng)的電子不僅可以還原三價(jià)鐵離子，同時(shí)還可以參與自由基反應(yīng)，使其生成穩(wěn)定的物質(zhì)。不同濃度下，青、紅花椒提取物的總還原力結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 青、紅花椒提取物總還原力Fig.1 The total reduction capacities of green and red peppers' extracts

由圖1可知，隨著溶液濃度的增加，6種青、紅花椒提取物的總還原力呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)趨勢(shì)。在0.3～0.7 mg/mL范圍內(nèi)，GE-50還原能力最強(qiáng)，其次是RE-100和RE-50，RE-W還原能力最弱，GE-100和GE-W還原能力比較接近，稍高于RE-W。隨濃度增加，GE-100、GE-W和RE-50的總還原力變化幅度較低，其他3種變幅較大，呈現(xiàn)較明顯的劑量效應(yīng)。

2.3 DPPH·清除活性

不同濃度條件下，青、紅花椒提取物的DPPH·清除率見(jiàn)圖2。

圖2 青、紅花椒提取物DPPH·清除率Fig.2 The DPPH· elimination rates of green and red peppers' extracts

由圖2可知，在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，6種青、紅花椒提取物DPPH·清除率均隨濃度增加呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì)。其中，RE-100顯示出最高的清除效果，在0.5 mg/mL時(shí)即達(dá)到80%的清除效果。其次是GE-50和RE-50，在1.5 mg/mL時(shí)均接近90%。GE-W DPPH·清除率隨濃度增加變化最大，當(dāng)濃度在2.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，明顯高于RE-W和GE-100。

2.4 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性

脂質(zhì)過(guò)氧化是自由基產(chǎn)生和參與的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，每一步都會(huì)有自由基中間產(chǎn)物的產(chǎn)生及參與。亞油酸是油脂中較常見(jiàn)的一種多不飽和脂肪酸，易發(fā)生氧化，常用來(lái)衡量物質(zhì)的體外抗氧化活性。不同濃度下，青、紅花椒提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制效果見(jiàn)圖3。

圖3 青、紅花椒提取物脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性Fig.3 The lipid peroxidation inhibitory activities of green and red peppers' extracts

由圖3可知，在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，6種青、紅花椒提取物均顯示出較高的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性，且均隨濃度增加而增大。在濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其抑制率也在62%～76%之間。RE-W 和GE-50的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性較低，其余4種相對(duì)較高，且在濃度1.0 mg/mL時(shí)，變化趨于平穩(wěn)，且比較接近，達(dá)到最高值，均在94%以上，其中GE-W抑制率最高。

2.5 抗脂質(zhì)過(guò)氧化動(dòng)力學(xué)

1.0 mg/mL GE-W對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。

圖4 不同時(shí)間內(nèi)青花椒水提取物脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率Fig.4 The lipid peroxidation inhibitory rates of green peppers' extracts under different time

由圖4可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，提取物的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性不是固定不變的，呈現(xiàn)明顯的增強(qiáng)趨勢(shì)，且呈現(xiàn)明顯的3個(gè)階段。在0～12 h內(nèi)，提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制活性呈線性增加；在12～24 h之間，其抑制率變化平緩；24 h以后又有較明顯的增加。以上3個(gè)階段的形成，可能是由于在開始階段，樣品中抗氧化組分濃度較高，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制速度增加較快；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，抗氧化組分逐漸消耗或飽和，致使其抑制活性增幅緩慢；之后的明顯增加，可能與體系中具有抗氧化活性的中間物質(zhì)的生成有關(guān)，具體原因還有待分析。

2.6 對(duì)NO2-的清除活性

亞硝酸鹽(NO2-)可使血液載氧能力下降，從而導(dǎo)致一些疾病。另外，亞硝酸鹽攝入人體后可與體內(nèi)胺類物質(zhì)結(jié)合，形成強(qiáng)致癌物N-亞硝基化合物，因此，具有清除NO2-活性的物質(zhì)被認(rèn)為具有降低食品中NO2-含量，從而顯示一定的抗癌作用。所以，通常也將NO2-清除能力作為衡量物質(zhì)體外抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。不同濃度下，青、紅花椒提取物對(duì)NO2-的清除活性見(jiàn)圖5。

圖5 青、紅花椒提取物對(duì)NO2-的清除活性Fig.5 The NO2-elimination activities of green and red peppers' extracts

由圖5可知，在0.05～0.25 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，6種青、紅花椒提取物均顯示出較高的NO2-清除活性，且清除率隨濃度增大而增加。其中，在0.05 mg/L時(shí)，GE-50清除率最低，隨濃度增加，清除率明顯增加，并逐漸趨于平緩。其余5種提取物在較低濃度(0.05 mg/mL)下即顯示出較高的NO2-清除活性(67%～76%)，且不同提取物之間差異較小，以RE-100和GE-100的清除率最高。

2.7 不同提取物的體外抗氧化能力比較

維生素C(VC)是膳食中普遍存在的一種水溶性維生素，也是食品中公認(rèn)的天然高效抗氧化組分。以LC50值為衡量標(biāo)準(zhǔn)，不同青、紅花椒提取物與VC的抗氧化作用見(jiàn)表2和表3。

表2 青、紅花椒提取物體外抗氧化活性LC50值Table 2 The LC50 values of antioxidant activities in vitro of green and red peppers' extracts

注：LC50是指發(fā)揮50%體外抗氧化活性時(shí)的樣品溶液濃度，mg/mL。

表3 不同濃度Vc溶液體外抗氧化活性分析Table 3 The antioxidant activities analysis in vitro of Vc solution with different concentration

與Vc溶液相比，6種提取物顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力和NO2-清除能力，遠(yuǎn)高于Vc，RE-100的DPPH·清除率也優(yōu)于Vc，但是總還原力均小于Vc。不同提取物之間，總還原力最高的是GE-50，其次是RE-100，最低的是RE-W。DPPH·清除效果，以RE-100最強(qiáng)，其次是GE-50和RE-50，最小的是2種水提取物。對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力以GE-100和GE-W最強(qiáng)，對(duì)NO2-的清除效果以GE-100最好。

3 結(jié)論

分別采用無(wú)水乙醇、50%乙醇和蒸餾水從青、紅花椒中獲得6種花椒提取物，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了分析比較。結(jié)果顯示：不同花椒提取物具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，且呈現(xiàn)不同程度的量效關(guān)系。與天然抗氧化劑VC相比，6種提取物顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力和NO2-清除能力，RE-100的DPPH·清除率也優(yōu)于VC，但是總還原力均小于VC。不同提取物之間，總還原力最高的是GE-50，其次是RE-100，最低的是RE-W。DPPH·清除效果，以RE-100最強(qiáng)，其次是GE-50和RE-50，最小的是2種水提取物。對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力以GE-100和GE-W最強(qiáng)，對(duì)NO2-的清除效果以GE-100最好。以上結(jié)果表明:青、紅花椒提取物抗氧化作用存在明顯差異。2種花椒提取物具有非常優(yōu)良的體外抗氧化活性，尤其是在抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除NO2-方面，遠(yuǎn)高于VC，在含脂食品的防腐保鮮方面顯示出很好的應(yīng)用前景。