諶斌，于方明，何歡，陸兵

(1.廣西高校巖溶生態(tài)與環(huán)境變化研究重點實驗室，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學環(huán)境與資源學院，廣西 桂林 541004；3.桂林淮安天然保健品開發(fā)有限公司，廣西 桂林 541004)

竹蓀隸屬于腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬，常見并可供食用的有4種：長裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀和棘托竹蓀。竹蓀有著很高的營養(yǎng)價值和藥用功效，其子實體中含有21種氨基酸以及多種維生素，同時它也富含多糖和多種微量元素[1-3]，因而具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老等作用[4-6]。另外，竹蓀對食品防腐有奇效，“與肉共食,味鮮防腐”，在夏季加入竹蓀的煮熟菜肴可以保持較長時間不腐敗變質，究竟是什么成分在起作用，目前尚不清楚[7]。

竹蓀抑菌作用的研究目前主要集中在竹蓀干子實體有機溶劑提取液對細菌和真菌的抑制作用上，如檀東飛等對棘托竹蓀菌蓋的化學成分及抑菌作用進行了研究，結果表明棘托竹蓀菌蓋的揮發(fā)油對細菌、霉菌、酵母菌有抑制作用[8-10]。而以棘托竹蓀菌絲體作為一種新型食品防腐劑的研究報道不多。棘托竹蓀是我國科學工作者于1986年在湖南省會同縣首次發(fā)現，并于1988年定名的竹蓀新種。該菌香氣濃郁，味道鮮美，現已在我國南方一些地區(qū)大面積栽培。本文就此進行了棘托竹蓀干子實體與菌絲體抑菌作用的比較研究，以期為將棘托竹蓀菌絲體開發(fā)為天然食品防腐劑奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

棘托竹蓀(Dictyophoraechinovolvata)：購自華中農業(yè)大學食用菌研究中心；抗菌性供試菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichodermaviride)等：由本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，用于培養(yǎng)細菌。

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，七水硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，自然pH，培養(yǎng)棘托竹蓀、酵母菌和霉菌用。

1.3 主要試劑

乙醇、丙酮、乙酸乙酯：均為國產分析純試劑。

1.4 棘托竹蓀干子實體

購自廣西桂林市七星農貿市場，50 ℃烘干并用粉碎機粉碎后備用。

1.5 方法

1.5.1 菌株的活化

將保藏于冰箱中的上述菌種接種于相應斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)好后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 平板培養(yǎng)基制備

配制好的固體培養(yǎng)基，于121 ℃高壓蒸汽滅菌后，冷卻至45 ℃，在超凈工作臺中將其傾注于無菌的培養(yǎng)皿中，每皿15 mL，凝固后備用。

1.5.3 供試菌株菌懸液的制備及平板接種

用接種針或接種環(huán)在無菌室中挑取細菌和真菌少許斜面培養(yǎng)物于裝有9 mL無菌水的試管中，制成菌懸液。大腸桿菌和枯草桿菌，用比濁法計數，酵母菌和霉菌孢子用血球計數板計數。調整菌懸液的濃度至含細胞數或孢子數106～107個/mL，用移液槍移取0.1 mL菌懸液于平板培養(yǎng)基上，用無菌三角刮鏟將菌液均勻涂布。

1.5.4 棘托竹蓀干子實體提取液的制備

用電子天平稱取6.00 g棘托竹蓀干子實體，分成三等份各2.00 g裝于三角錐形瓶中(分別編號為1,2,3)。在1號錐形瓶中裝入50 mL乙醇，2號錐形瓶中裝入50 mL丙酮，3號錐形瓶中裝入50 mL乙酸乙酯，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱浸泡18 h，過濾并保留濾液，濾渣再各加入50 mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯浸泡18 h，過濾后的濾液與前一次的濾液合并。將濾液加熱濃縮后分別得到不同有機溶劑的棘托竹蓀干子實體提取液[11,12]。

1.5.5 濾紙圓片測試培養(yǎng)

用打孔器將新華一號定性濾紙打成直徑6 mm的小圓紙片，放進培養(yǎng)皿中121 ℃高壓蒸汽滅菌，將滅菌濾紙片分別浸入不同的棘托竹蓀子實體浸提液中浸透。將浸好的濾紙片貼在制備好的接種平板上，將培養(yǎng)皿一分為二，一邊貼提取液濾紙片，一邊貼無菌蒸餾水空白對照濾紙片，每邊3片[13]。貼好濾紙片的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌于35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，霉菌、酵母菌44～48 h，測量抑菌圈直徑。

1.5.6 棘托竹蓀菌絲培養(yǎng)及其提取液抑菌試驗

將活化后的棘托竹蓀斜面菌種菌絲接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)12天，從玻璃紙刮下培養(yǎng)好的菌絲體并置于三角錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯在28 ℃條件下浸提菌絲體18 h，過濾并保留濾液，濾渣再加入50 mL乙酸乙酯浸泡18 h，過濾后的濾液與前一次的濾液合并，將濾液加熱濃縮后得到棘托竹蓀菌絲體提取液，采用濾紙圓片法進行棘托竹蓀菌絲體提取液抑菌試驗，同時進行棘托竹蓀干子實體提取液抑菌試驗。

1.5.7 食物防腐試驗

將豬肉、豆腐、土豆切成小塊并等分成5份，分別加入棘托竹蓀濕子實體粉及其浸提液、棘托竹蓀菌絲體及其浸提液、冷開水(作為對照樣)，烹熟，置于35～37 ℃下保溫48 h，肉眼觀察食物的動態(tài)變化[14]。

2 結果與討論

2.1 棘托竹蓀干子實體提取液抑菌作用

棘托竹蓀干子實體提取濃縮液呈淺黃色，有棘托竹蓀的清香味，抑菌試驗的結果表明棘托竹蓀干子實體提取液對細菌和真菌都有抑制作用，特別是對細菌有很強的抑制效果；棘托竹蓀子實體不同提取液對細菌和真菌的抑制效果有差別，乙酸乙酯提取液的抑制作用最強，供試菌株被抑制的程度大小依次是：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、綠色木霉(見表1)。說明棘托竹蓀干子實體提取液中含有抗菌活性物質，具體的有效成分及其抑菌機理有待以后進一步研究探討。

表1 棘托竹蓀干子實體提取液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，隨著+增加表示抑菌作用越大，-表示無抑菌作用。

2.2 棘托竹蓀菌絲體乙酸乙酯提取液的抑菌作用

棘托竹蓀菌絲體的乙酸乙酯提取液對細菌和真菌有抑制作用，抑制效果和其干子實體乙酸乙酯提取液的抑菌效果差不多(見表2)，而棘托竹蓀子實體栽培時間長達3～4個月，且需占用大面積土地,而通過深層培養(yǎng)或固態(tài)靜止培養(yǎng)可快速獲得棘托竹蓀菌絲體，為進一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體的有效抑菌活性成分提供一定的科學依據和可能。

表2 棘托竹蓀菌絲體與干子實體浸提液的抑菌作用

注：+表示有抑菌作用，隨著+增加表示抑菌作用越大，-表示無抑菌作用。

2.3 食物防腐試驗

食物防腐試驗的效果見表3。

表3 食物防腐試驗

由表3可知，3種食物的對照系列均有不同程度的腐爛，尤其是肉類，加入冷開水的具有惡臭味。3種食物中加入棘托竹蓀濕子實體和菌絲體烹熟后的系列在高溫中保存2天的時間，有微餿味出現，而加入棘托竹蓀子實體提取液和菌絲體提取液的食物中，只有肉類有少許的餿味，其他2種食物沒有發(fā)現腐敗變質?？梢娂兄裆p中確有抑菌成分存在，用乙酸乙酯提取后抑菌效果更佳，棘托竹蓀干子實體和菌絲體的抑菌效果差不多，為下一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體為天然食品防腐劑奠定一定基礎。

3 結論

棘托竹蓀的干子實體和菌絲體中均含有抗菌活性物質，用乙酸乙酯提取濃縮后抑菌效果更佳，干子實體和菌絲體的抑菌效果相差不大，而菌絲體可以通過液體發(fā)酵培養(yǎng)在短期內大量獲得，相對容易和簡單，為下一步開發(fā)利用棘托竹蓀菌絲體為天然食品防腐劑奠定一定基礎。