徐煒楨

(1.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610039；2.四川省丹丹郫縣豆瓣股份有限公司，成都 611732； 3.四川友聯(lián)味業(yè)食品有限公司，成都 611732)

黃曲霉毒素是最常見的一類真菌毒素，是黃色曲霉菌或寄生曲霉菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一組有毒代謝產(chǎn)物，在自然界中廣泛存在，尤其對(duì)玉米[1]、大米[2]、花生[3]、辣椒[4]和豆類發(fā)酵食品[5]等造成污染。黃曲霉毒素是次生代謝產(chǎn)物，主要對(duì)人類和動(dòng)物的RNA和DNA的合成進(jìn)行干擾，當(dāng)RNA和DNA不能進(jìn)行合成時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受阻，最后使得動(dòng)物基因突變，產(chǎn)生致癌物[6]，常見的黃曲霉毒素有B1，B2，G1，G2，M1 5種，其中B1為毒性及致癌、致畸和致突變最強(qiáng)的物質(zhì)，是一種毒性最強(qiáng)的天然物質(zhì)。黃曲霉毒素Bl(AFB1)的半數(shù)致死量為0.36 mg/kg體重，砒霜的半數(shù)致死量是14.6 mg/kg體重，比砒霜大68倍，是一種劇毒物質(zhì)，損害人和動(dòng)物的肝臟，造成人和動(dòng)物代謝系統(tǒng)的紊亂，引起肝細(xì)胞壞死、肝硬化，誘發(fā)肝癌、胃癌等，嚴(yán)重的引起人和動(dòng)物惡心、嘔吐、死亡等[7]。

郫縣豆瓣屬中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，具有味辣香醇、紅棕油亮、粒稠絨實(shí)、醬香濃郁的特點(diǎn)，是烹飪川菜必不可少的調(diào)味品，在世界發(fā)酵辣椒醬中別具一格，它在選材上與工藝上與眾不同，可謂是“川菜之魂”[8,9]。郫縣豆瓣產(chǎn)業(yè)是郫縣重要的支柱產(chǎn)業(yè)之一，其產(chǎn)業(yè)總量已經(jīng)占中餐總量的35%以上，郫縣豆瓣每年銷售額逐年增加，1999年開始，郫縣豆瓣銷售總量達(dá)到5萬噸，銷售收入總額為5萬噸，銷售總收入為2.5億元；在2010年，郫縣豆瓣銷售總量達(dá)到45萬噸，銷售總收入為18億元；到2015年末，郫縣豆瓣銷售總量達(dá)到110萬噸，銷售總收入為102億元[10]。

郫縣豆瓣在發(fā)酵過程中分為發(fā)酵制曲階段、發(fā)酵初期、發(fā)酵后期3個(gè)階段[11]。制曲階段主要是通過米曲霉等菌種在原料上生長繁殖，利用它們分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶類，是豆瓣生產(chǎn)中最重要的質(zhì)量控制點(diǎn)[12]；發(fā)酵初期階段(10～60天)是將曲瓣子與鹽水按比列混合發(fā)酵，制成成熟瓣子(甜瓣子)；發(fā)酵后期(60～240天)是先制好甜瓣子，然后將甜瓣子和辣椒按一定比例混合均勻攪拌，隨后加入食鹽和水進(jìn)行攪拌，倒入發(fā)酵池進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過一段時(shí)間的不斷翻曬和陳化[13]。因?yàn)閭鹘y(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)豆瓣處于比較粗放的境況：第一，生產(chǎn)用菌不同程度地產(chǎn)生黃曲霉毒素；第二，由于生產(chǎn)所用的米曲霉、黑曲霉等與黃曲霉的生化條件相近，控制不嚴(yán)極易被雜菌污染，產(chǎn)生黃曲霉毒素[14]；第三，在郫縣豆瓣發(fā)酵的管理過程中很難避免AFB1的污染，而在烹飪過程中也不能將AFB1去除[15]，常出現(xiàn)AFB1超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量的問題，帶來食品質(zhì)量安全隱患。目前，AFB1對(duì)食品污染的問題已引起了全國的高度重視，并開展了廣泛的研究，取得了顯著的成果，且各國根據(jù)各自的國情制定不同食品及動(dòng)物飼料中AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)，控制或降低AFB1污染對(duì)人群健康造成的危害。

為初步了解成都市郫縣豆瓣中AFB1的污染狀況，制定控制措施，提高監(jiān)管水平，降低風(fēng)險(xiǎn)。我們從不同渠道采集郫縣豆瓣樣品共296批次，在春夏季節(jié)和秋冬季節(jié)分別為124批次和172批次，對(duì)一整年郫縣豆瓣中AFB1進(jìn)行測定污染情況，然后再分別對(duì)秋冬季節(jié)郫縣豆瓣中AFB1和春夏季節(jié)郫縣豆瓣中AFB1含量進(jìn)行測定，通過春夏季節(jié)與秋冬季節(jié)中AFB1含量的變化及比較，來思考季節(jié)溫差對(duì)郫縣豆瓣中AFB1的影響，以期為郫縣豆瓣的食品安全監(jiān)管提供可靠依據(jù)，為制定郫縣豆瓣中AFB1控制措施提供科學(xué)合理的根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料采集

在春夏季節(jié)：在春夏季節(jié)共取樣124批次，分別來自四川大型企業(yè)合計(jì)47批次；大型商場(紅光世紀(jì)百盛購物廣場、步步高郫縣紅光店、紅旗連鎖、蜀都萬達(dá)永輝超市)合計(jì)19批次；農(nóng)貿(mào)市場(犀浦農(nóng)貿(mào)市場、青白江成剛菜市場、紅光農(nóng)貿(mào)市場、志陽農(nóng)貿(mào)市場)合計(jì)41批次；紅光鎮(zhèn)批發(fā)市場合計(jì)17批次。

在秋冬季節(jié)：在秋冬季節(jié)共取樣172批次，分別來自四川大型企業(yè)合計(jì)88批次；大型商場(紅光世紀(jì)百盛購物廣場、步步高郫縣紅光店、紅旗連鎖、蜀都萬達(dá)永輝超市)合計(jì)23批次；農(nóng)貿(mào)市場(犀浦農(nóng)貿(mào)市場、青白江成剛菜市場、紅光農(nóng)貿(mào)市場、志陽農(nóng)貿(mào)市場)合計(jì)44批次；紅光鎮(zhèn)批發(fā)市場合計(jì)17批次。

1.2 試劑

甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)、石油醚、三氯甲烷(分析純，成都市科龍化工試劑廠)、抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結(jié)合物：1瓶(6 mL)ELISA kit(德國R-Biopharm公司)、顯色液A:1瓶(6 mL)、顯色液B:1瓶(6 mL)、終止液：1瓶(6 mL)，2 mol/L硫酸、樣本稀釋液：1瓶、濃縮洗滌液：1瓶、黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶(1 mL/瓶)，含量分別是：0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/L。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取郫縣豆瓣樣品30 g左右，研磨至均勻糊狀后放入保鮮袋中密封保存放入冰箱中備用。

1.3.2 黃曲霉毒素B1提取

提取方法根據(jù)國標(biāo)方法改進(jìn)[16]，將研磨好的豆瓣從冰箱中取出先在室溫中放置30 min，準(zhǔn)確稱取豆瓣15 g，加入到250 mL錐形瓶中，然后加入50.0 mL甲醇-水溶液和15 mL石油醚蓋塞，密封后放入搖床，在150 r/min條件下振蕩30 min，等待搖床停止后，用快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，靜止5 min，放出下層溶液至燒杯中，從中取20 mL置于另一分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，振蕩2 min后等待靜置分層，然后放出下層的三氯甲烷于蒸發(fā)皿中，再在分液漏斗中加入10 mL三氯甲烷搖晃振蕩2 min，等待分層后放出下層三氯甲烷于蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿放在70 ℃水浴中揮干，揮干后加入3 mL甲醇溶液，溶解凝結(jié)物，將溶液移置試管中保存。

1.3.3 檢測方法

測量方法依據(jù)試劑盒說明書上面的方法進(jìn)行測定，具體如下：取適量微孔板固定在板架上面放于桌面上，先依次加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再順序加入50 μL樣品溶液，最后在所有具有溶液的孔中加入50 μL抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結(jié)合物，輕輕晃動(dòng)幾秒鐘使之混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中30 min，在此過程中不時(shí)地將板架取出來輕輕地拍打晃動(dòng)，目的是使之充分混合均勻減少雙孔誤差；水浴結(jié)束后，取出孔板甩掉孔中溶液，用洗滌液洗滌微孔板4～5次，最后在吸水紙上拍打除去孔中液體。

1.3.4 反應(yīng)

洗滌完成甩掉孔中溶液后，在微孔中加入50 μL顯色液A，再加入50 μL顯色液B，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板使之徹底混合均勻，再放于37 ℃水浴鍋中水浴10 min，最后在每個(gè)孔中加入50 μL終止液。

1.3.5 檢測

待反應(yīng)完成后在450 nm下檢測吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的吸光值取平均值，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光值的平均值再乘以100%，即百分吸光度，設(shè)為Y軸；以黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對(duì)數(shù)值為X軸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測得百分吸光度Y軸與標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對(duì)數(shù)值X軸的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，再根據(jù)樣品的百分吸光度值，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)，即樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度的對(duì)數(shù)值，然后求其反對(duì)數(shù)即為樣品溶液中的黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度c(μg/L)。樣品中黃曲霉毒素B1含量為：

式中：X為樣品中所含黃曲霉毒素B1含量；c為在標(biāo)準(zhǔn)曲線中每個(gè)樣品的百分吸光度值所對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值；k為豆瓣樣品加水稀釋的倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總體情況

將系列AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg)測得吸光度值，繪制AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，以黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度為Y軸，得到線性方程y=-0.5121x+0.6728，R2=0.99，可知，標(biāo)準(zhǔn)方程的R2在0.99以上，說明在給定的測量條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好。

圖1 AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of AFB1

2.2 不同來源郫縣豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1的污染情況

表1 不同來源郫縣豆瓣樣品中AFB1的污染情況Table 1 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste from different sources

注：“ND”表示低于檢測限(0.2 μg/kg)。

由表1可知，AFB1污染情況差異較大，AFB1污染嚴(yán)重程度依次為(由大到小排序)農(nóng)貿(mào)市場(3.915 μg/kg)>批發(fā)市場(3.495 μg/kg)>大型商超(3.153 μg/kg)>重點(diǎn)企業(yè)(2.749 μg/kg)；農(nóng)貿(mào)市場的最高值(7.119 μg/kg)與最低值(2.487 μg/kg)均高于其他3個(gè)地方的最高值和最低值，大型商超、批發(fā)市場、重點(diǎn)企業(yè)合格率均高于平均合格率，只有農(nóng)貿(mào)市場合格率較低，說明農(nóng)貿(mào)市場是AFB1污染最嚴(yán)重的，并且農(nóng)貿(mào)市場中郫縣豆瓣產(chǎn)品給消費(fèi)者帶來的食品安全風(fēng)險(xiǎn)較大，監(jiān)管部門應(yīng)該作為重點(diǎn)監(jiān)管對(duì)象，另外，對(duì)于消費(fèi)者來說長期使用含有AFB1含量偏高的豆瓣，對(duì)健康有嚴(yán)重的危害的，嚴(yán)重的可以引起肝損傷，以至癌變，所以消費(fèi)者應(yīng)盡量選擇重點(diǎn)企業(yè)或者大型商超的豆瓣；同時(shí)，從郫縣豆瓣整體來看，合格率在94.60%，一共抽樣296個(gè)樣品，就有16個(gè)不合格，超過我國在GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食物中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定黃曲霉毒素B1的限量，其中黃曲霉毒素在發(fā)酵豆瓣中的限量不得超過 5 μg/kg。說明AFB1污染郫縣豆瓣總體形勢不容樂觀，在豆瓣中存在安全隱患，監(jiān)管部門應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)發(fā)酵豆瓣中AFB1的防治、檢測與管理。

2.3 不同季節(jié)郫縣豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1的污染情況

表2 不同季節(jié)郫縣豆瓣樣品中AFB1的污染情況Table 2 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste in different seasons

注：“ND”表示低于檢測限(0.2 μg/kg)。

春、夏季，我們從四川大型企業(yè)、農(nóng)貿(mào)市場、大型商超、批發(fā)市場等地分別采集樣品共124個(gè)，在這124個(gè)樣品中，一共檢測了120個(gè)樣品，檢出率為96.77%。AFB1超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量5.0 μg/kg的樣品共有9個(gè)，產(chǎn)品合格率達(dá)92.74%。

秋、冬季，我們從四川大型企業(yè)、農(nóng)貿(mào)市場、大型商超、批發(fā)市場等地分別采集樣品共172個(gè)，在這172個(gè)樣品中，一共檢測了170個(gè)樣品，檢出率為98.88%。AFB1超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量5.0 μg/kg的樣品共有6個(gè)，產(chǎn)品合格率達(dá)96.47%。

在秋冬季節(jié)豆瓣中AFB1的平均含量為3.057 μg/kg，在春夏季節(jié)豆瓣中AFB1的平均含量為3.566 μg/kg，秋冬季節(jié)最高值(6.475 μg/kg)小于春夏季節(jié)最高值(7.119 μg/kg)，秋冬季節(jié)AFB1合格率為96.47%，春夏季節(jié)AFB1合格率為92.74%；可以得出在秋冬季節(jié)豆瓣中AFB1污染情況均比在春夏季節(jié)豆瓣中AFB1的污染情況小，季節(jié)對(duì)郫縣豆瓣中AFB1的污染有一定的影響，在秋冬季節(jié)比在春夏季節(jié)污染情況要低。

3 討論與結(jié)論

從一年的總體情況來看，郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1的合格率為94.60%，大型商超、批發(fā)市場、重點(diǎn)企業(yè)的合格率均高于平均合格率，只有農(nóng)貿(mào)市場的合格率較低，所以可以看出郫縣豆瓣受AFB1的污染總體情況良好，只有農(nóng)貿(mào)市場的情況不容樂觀。

對(duì)于春夏季節(jié)與秋冬季節(jié)郫縣豆瓣中AFB1含量的差異，秋冬季節(jié)時(shí)郫縣豆瓣中AFB1的合格率明顯低于春夏季節(jié)時(shí)郫縣豆瓣中AFB1的合格率；在秋冬季節(jié)測定AFB1的平均值含量明顯低于在春夏季節(jié)測定AFB1的含量；在秋冬季節(jié)AFB1最高值、最低值都低于春夏季節(jié)AFB1含量。因?yàn)辄S曲霉毒素主要由寄生曲霉和產(chǎn)毒黃曲霉分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝物，由于春夏季節(jié)和秋冬季節(jié)的溫差變化，造成酶的活性不同，并且黃曲霉菌生長繁殖及其在天然基質(zhì)中產(chǎn)生黃曲霉毒素所需要的最低相對(duì)濕度為14%左右，所需最適宜的溫度為25～30 ℃[17]，水分含量超過10%，非常容易造成黃曲霉毒素的污染和毒素積累，所以在秋冬季節(jié)濕度和溫度較低，而在春夏季節(jié)濕度和溫度都較高，適應(yīng)AFB1的生長，所以導(dǎo)致AFB1的含量有差異?？梢缘贸黾竟?jié)對(duì)郫縣豆瓣中寄生曲霉和產(chǎn)毒黃曲霉分泌產(chǎn)生的黃曲霉毒素有一定的影響，食品安全監(jiān)管應(yīng)該把春夏季節(jié)作為檢查的重點(diǎn)，生產(chǎn)廠家也可以根據(jù)季節(jié)來控制減少AFB1的污染，給消費(fèi)者帶來食品安全的保障[18]。

加強(qiáng)對(duì)AFB1的防治措施從兩個(gè)方面進(jìn)行，一是預(yù)防，二是處理降低AFB1。預(yù)防郫縣豆瓣受污染的途徑應(yīng)當(dāng)包括生產(chǎn)豆瓣的原料、生產(chǎn)和存儲(chǔ)全過程；處理降低AFB1的方法有堿處理法、氧化處理法、吸附劑脫毒、高溫處理法、黃曲霉毒素生物降解、微生物代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素[19]。而本研究通過對(duì)一整年豆瓣中AFB1污染情況的調(diào)查，比較春夏季節(jié)和秋冬季節(jié)豆瓣中AFB1含量的不同，分析了我市郫縣豆瓣在不同季節(jié)AFB1含量的總體狀況，為建立我市郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1的應(yīng)急對(duì)策與預(yù)警體系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，讓我們思考可以從不同的季節(jié)對(duì)豆瓣進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，來降低AFB1的污染，也可以通過溫度來控制AFB1的產(chǎn)生，為我國對(duì)發(fā)酵豆瓣中防治AFB1提供新思路。