侯靖，徐佳琪，崔恒林

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

蛋白酶是一類非常重要的水解酶，目前在全球酶制劑市場占到46%的份額，廣泛應用于食品、洗滌、醫(yī)藥、皮革等領域[1]。在調味品如醬油、食醋、腐乳生產中，添加蛋白酶有利于蛋白質降解，既可提高原料利用率，縮短發(fā)酵周期，降低生產成本，又可改進產品質量和風味。目前商業(yè)化的蛋白酶在高鹽等極端環(huán)境中不能有效地發(fā)揮作用，限制了在高鹽調味品生產中的應用。

嗜鹽古菌通常生活在高鹽環(huán)境如鹽湖、鹽場、鹽礦和腌制品中。研究表明，嗜鹽古菌胞外蛋白酶可以應用于一些極端環(huán)境，如有機溶劑中多肽合成[2]、縮短高鹽調味品魚露發(fā)酵周期等[3]，從而填補了蛋白酶的應用空白[4]。然而，目前報道的嗜鹽古菌胞外蛋白酶通常依賴高鹽環(huán)境維持活性和穩(wěn)定性[5-11]，低鹽條件不可逆變性失活，從而增加了純化難度以及限制了應用范圍。從自然環(huán)境中篩選耐鹽、穩(wěn)定性強的嗜鹽古菌胞外蛋白酶成為近年來國內外學者的研究熱點[12，13]。我國高鹽環(huán)境豐富多樣，為嗜鹽古菌蛋白酶資源的研究提供了很好的材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

從西藏芒康鹽井古鹽田分離的133株嗜鹽古菌。

PCR擴增試劑盒、酪蛋白、脫脂奶粉：購自上海生工生物技術服務有限公司。NHM培養(yǎng)基、HM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基按文獻[14]配制。pH 6.0緩沖液為50 mmol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液；pH 7.0，8.0，9.0緩沖液均為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 10.0，11.0緩沖液均為50 mmol/L硼砂-氫氧化鈉緩沖液。

1.2 主要儀器設備

電子天平 上海精科天平儀器廠；pHS-3TC型酸度計 上海天達儀器有限公司；HBA-1151 PCR儀 MJ Research公司；Avanti J-14離心機 Beckman公司； DU800核酸蛋白分析儀 Beckan-Coulter公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產胞外蛋白酶能力的初步評價

取5 μL菌液接種含5 g/L脫脂奶粉的NHM平板，37 ℃培養(yǎng)，通過觀察菌苔周圍的牛乳蛋白水解圈，篩選產胞外蛋白酶菌株。根據(jù)牛乳蛋白水解圈直徑與菌苔直徑之比初步評價牛乳蛋白水解能力。類似地，將菌液接種含5 g/L明膠的NHM平板，將Frazier試劑(HgCl215 g；濃HCl 20 mL；無菌水100 mL)滴加于菌苔周圍檢測明膠水解圈。根據(jù)明膠水解圈直徑與菌苔直徑之比初步評價明膠水解能力。

1.3.2 培養(yǎng)基對產胞外蛋白酶能力的影響

取5 μL經NHM，HM和CM培養(yǎng)基活化后的菌液分別接種含5 g/L脫脂奶粉或明膠的NHM，HM和CM平板，于37 ℃培養(yǎng)7天，肉眼觀察牛乳蛋白水解圈，用Frazier試劑檢測明膠水解圈。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

以水裂解法提取嗜鹽古菌基因組作為PCR模板。PCR擴增引物為0018F和1518R[15]。PCR產物由北京諾賽基因組研究中心測序。NCBI BLAST用于基因序列分析。

1.3.4 細胞計數(shù)

經NHM培養(yǎng)基活化后的2 mL XZYJ18菌液接種到100 mL NHM培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)，每隔一段時間進行細胞計數(shù)。取0.5 mL菌液置于4.5 mL NHM培養(yǎng)基中，充分混勻，此時稀釋度為10-1，依次稀釋至10-7；10-6和10-7稀釋度樣品分別取0.5 mL均勻平鋪NHM平板(3個平行)，37 ℃培養(yǎng)7天。取菌落數(shù)在25～250之間的平板計數(shù)。細胞數(shù)目(cfu/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×2。采用類似的方法測定NHMY培養(yǎng)基(NHM培養(yǎng)基添加5 g/L酵母提取物)中的細胞數(shù)目。

1.3.5 蛋白酶活力的測定

經NHM或NHMY培養(yǎng)基活化后的4 mL XZYJ18菌液接種到200 mL NHM或NHMY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期。培養(yǎng)液離心去除細胞，上清經超濾離心管(10 kDa，Millipore)濃縮10倍后，再用一定pH、NaCl濃度的緩沖液將酶液稀釋10倍用于調節(jié)酶液的pH、NaCl濃度，即得胞外蛋白酶粗酶液。參照文獻[14]，根據(jù)福林酚法測定蛋白酶活力。

1.3.6 酶學性質研究

1.3.6.1 溫度對蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、pH 7.0的條件下測定35，40，45，50，55，60，65，70 ℃下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應溫度。

1.3.6.2 pH對蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法在2 mol/L NaCl、最適溫度下測定pH 6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應pH。

酶液于2 mol/L NaCl、pH 6.0，8.0，10.0的條件下于30 ℃放置0，20，40，60 min后，按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、最適pH、最適溫度下測定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.6.3 NaCl濃度對蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法在最適溫度、最適pH下測定0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mol/L NaCl下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應NaCl濃度。

酶液于最適pH、0，1.0，2.0，3.0 mol/L NaCl的條件下于30 ℃放置0，20，40，60 min，按1.3.5所述方法在1.5 mol/L NaCl、最適溫度、最適pH下測定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的NaCl濃度穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)測定3次，采用SPSS 18.0進行單因素方差分析和事后檢驗(Turkey法)，顯著水平設為0.05。

2 實驗結果與討論

2.1 產胞外蛋白酶菌株的篩選

由于嗜鹽古菌遺傳操作和生物化學技術建立得相對較晚，相對于豐富的高鹽環(huán)境和嗜鹽古菌資源，嗜鹽古菌胞外蛋白酶的研究相對較少。我國西藏芒康鹽井古鹽田歷史悠久，仍然保持著原始手工曬鹽方式。課題組前期研究了芒康鹽井古鹽田中可培養(yǎng)嗜鹽古菌的多樣性，本研究擬從分離的嗜鹽古菌中篩選高產胞外蛋白酶菌株。脫脂奶粉中含有大量的蛋白質，其中2種主要的蛋白質是酪蛋白和乳清蛋白，可采用脫脂奶粉平板驗證產胞外蛋白酶能力。

表1 產胞外蛋白酶菌株篩選結果Table 1 The screening results of extracellular protease producing strains

續(xù) 表

由表1可知，用NHM-脫脂奶粉平板篩選從西藏芒康鹽井古鹽田分離的133株嗜鹽古菌，共獲得11株產胞外蛋白酶菌株，分別為XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT35，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71。16S rRNA基因序列分析表明XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71的最相近菌株為Halorussusrarus，16S rRNA基因序列的相似性為94%～96%；XZYJT35的最相近菌株為Halomicrobiumzhouii，16S rRNA基因序列的相似性為91%。16S rRNA基因序列相似性小于98.65%通常認為屬于不同的種[16]，相似性小于95%認為屬于不同的屬[17]。因此，這11株嗜鹽古菌可能為新的分類單元，可能存在新型胞外蛋白酶資源。

通過牛乳蛋白和明膠水解圈直徑與菌苔直徑之比初步探究胞外蛋白酶酶活。結果表明，除了XZYJT35外，其他10株菌牛乳蛋白水解圈直徑與菌苔直徑比值均大于或等于2，明膠水解圈直徑與菌苔直徑比值均大于3，其中XZYJ18的比值最大，分別為5.2和9.6，表明XZYJ18的胞外蛋白酶具有較強的牛乳蛋白和明膠水解能力。用NHM培養(yǎng)基對這11株菌進行搖瓶發(fā)酵制備酶液，測定35 ℃、2 mol/L NaCl、pH 7.0條件下的酶活，XZYJ18酶活最高(p<0.05)，為9.6 U/mL，其他均低于或等于8.0 U/mL。總的來說，平板上水解圈直徑大小和搖瓶發(fā)酵蛋白酶活力的高低大致一致。XZYJ18用于后續(xù)蛋白酶合成條件和酶學性質研究。XZYJ18為Halorussus屬的新種，這是首次報道Halorussus屬具有產胞外蛋白酶能力，對高鹽環(huán)境中胞外蛋白酶資源的研究有利于豐富產蛋白酶嗜鹽古菌物種的種屬分布。

2.2 營養(yǎng)條件對XZYJ18蛋白酶合成的影響

圖1 XZYJ18在NHM-脫脂奶粉(a)、HM-脫脂奶粉(b)、CM-脫脂奶粉(c)、NHM-明膠(d)、HM-明膠(e)、CM-明膠(f)平板上培養(yǎng)7天的水解圈Fig.1 The hydrolysis zones of XZYJ18 cultured on NHM-milk (a), HM-milk (b), CM-milk (c), NHM-gelatin (d), HM-gelatin (e), and CM-gelatin (f) agar plates for 7 days

將XZYJ18菌株分別接種于常用的嗜鹽古菌培養(yǎng)基，即營養(yǎng)貧瘠的NHM、營養(yǎng)適中的HM、營養(yǎng)豐富的CM-脫脂奶粉或明膠平板，通過蛋白水解圈表征胞外蛋白酶酶活以探究適宜的產蛋白酶培養(yǎng)基。由圖1可知，不管是以脫脂奶粉還是明膠作為蛋白酶的水解底物，NHM平板上水解圈均最大，HM平板上水解圈次之，CM平板上未產生明顯水解圈。這可能是由于XZYJ18菌株在NHM培養(yǎng)基上生長最好，在HM培養(yǎng)基上生長次之，在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天幾乎沒有生長。隨后，通過在NHM培養(yǎng)基中添加5 g/L酵母提取物(NHMY)探究營養(yǎng)條件對XZYJ18生長及胞外蛋白酶合成的影響。

表2 XZYJ18在不同培養(yǎng)基中的胞外蛋白酶活性Table 2 Extracellular protease activities of XZYJ18 cultured in different media

由表2可知，與NHM培養(yǎng)基相比，在NHMY培養(yǎng)基中，XZYJ18生長達穩(wěn)定期時細胞數(shù)目增加了3.6倍，但酶活僅增加了60%，表明酵母提取物的添加導致單個細胞的酶活降低，約降低了64%，暗示了營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基可能會抑制蛋白酶合成。D' Alessandro等人發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌Natrialbamagadii營養(yǎng)受限時能夠大量積累胞外蛋白酶[18]，推測胞內能量匱乏誘導了胞外蛋白酶的合成，從而降解蛋白質大分子用于提供細胞生長所需的能量。另外，XZYJ18在NHM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h達到穩(wěn)定期，然而，在NHMY培養(yǎng)基中，需要168 h才能達到穩(wěn)定期。因此，在后續(xù)實驗中，采用NHM培養(yǎng)基培養(yǎng)XZYJ18菌株合成胞外蛋白酶。

2.3 生長時期依賴的胞外蛋白酶合成

圖2 XZYJ18產胞外蛋白酶與細胞生長的關系Fig.2 The relationship between extracellular protease production and cell growth of XZYJ18

由圖2可知，XZYJ18在對數(shù)生長后期開始大量合成胞外蛋白酶，當菌體生長達穩(wěn)定期后，酶活最高并趨于穩(wěn)定，推測培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的耗盡或者群感效應信號分子誘導了胞外蛋白酶的產生。同樣地，嗜鹽古菌Natrialbamagadii也是在對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡時大量產生胞外蛋白酶，認為穩(wěn)定期培養(yǎng)液中存在某種疏水的分子能夠誘導胞外蛋白酶合成[19]。然而，石萬良等人研究的嗜鹽古菌Natrinemasp. R6-5胞外蛋白酶合成與生長幾乎同步[20]，這說明嗜鹽古菌中存在不同的蛋白酶合成調控機制。對嗜鹽古菌蛋白酶合成條件的研究能夠為發(fā)酵條件的優(yōu)化提供指導，從而有利于其大規(guī)模生產用于基礎研究或工業(yè)應用。

2.4 XZYJ18胞外蛋白酶酶學性質

2.4.1 溫度對蛋白酶活性的影響

取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的培養(yǎng)液用于酶液制備及酶學性質研究。

圖3 溫度對XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖3可知，在35～70 ℃內，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著溫度升高先升高后降低，55 ℃時酶活最高(p<0.05)，在45～60 ℃內，酶活為最高酶活的80%以上。因此，與已報道的大部分嗜鹽古菌胞外蛋白酶一樣，XZYJ18的胞外蛋白酶具有一定的耐熱性。食品發(fā)酵通常要求在一定的溫度維持一段時間，因此，蛋白酶的耐熱性對于在食品工業(yè)中的應用非常重要。

2.4.2 pH對蛋白酶活性的影響

圖4 pH對XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖4可知，在pH 6.0～11.0內，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著pH升高先升高后降低，pH 8.0時酶活最高(p<0.05)，pH 7.0時酶活為最高酶活的81%，pH 9.0時酶活為最高酶活的76%。因此，XZYJ18胞外蛋白酶在中性和弱堿性條件下酶活較高。

圖5 XZYJ18胞外蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.5 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different pH values

由圖5可知，XZYJ18胞外蛋白酶在pH 6，8，10的條件下放置20，40，60 min酶活均沒有顯著變化(p>0.05)，表明其具有良好的酸堿穩(wěn)定性，因而在酸性或堿性條件下均能催化蛋白質水解，可應用于不同的食品工業(yè)。

2.4.3 NaCl濃度對蛋白酶活性的影響

嗜鹽古菌為高鹽環(huán)境中的主要微生物類群，嚴格依賴于高濃度的NaCl生長。嗜鹽古菌通過胞內積累高濃度的K+來維持細胞內外滲透壓的平衡。高鹽環(huán)境中的嗜鹽古菌蛋白質進化出了一系列獨特的特征與機制[21]，賦予了嗜鹽古菌酶類良好的耐鹽性。

圖6 NaCl濃度對XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖6可知，當NaCl濃度為0～1.5 mol/L時，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著鹽濃度增加逐漸降低。當NaCl濃度為1.5～3.0 mol/L時，XZYJ18胞外蛋白酶活性沒有明顯變化(p>0.05)，約為最高酶活的62%。因此，雖然XZYJ18菌株分離于高鹽環(huán)境，其胞外蛋白酶卻在無鹽條件下展示最高酶活，但在高NaCl濃度下也能保持較高酶活。

圖7 XZYJ18胞外蛋白酶的鹽度穩(wěn)定性Fig.7 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different NaCl concentration

由圖7可知，XZYJ18胞外蛋白酶在0，1，2，3 mol/L NaCl下放置20，40，60 min，酶活均沒有明顯變化(p>0.05)。目前報道的大部分嗜鹽古菌胞外蛋白酶依賴于高鹽環(huán)境高效發(fā)揮作用，如HalogeometricumborinquenseTSS101的胞外蛋白酶最適反應NaCl濃度為20%，在沒有NaCl的條件下完全失活[22]；Natrinemasp. R6-5的胞外蛋白酶在3 mol/L NaCl的條件下酶活最高，在0.5 mol/L NaCl的條件下酶活為最高酶活的40%。因此，不同于很多高鹽依賴的嗜鹽古菌蛋白酶，XZYJ18胞外蛋白酶在高、低NaCl濃度下均具有較高活性及穩(wěn)定性，該特性使得它能夠應用于不同鹽濃度的環(huán)境中，因而在食品工業(yè)將具有廣泛應用。

3 結論

本研究從分離自我國西藏芒康鹽井古鹽田的133株嗜鹽古菌中篩選出11株產胞外蛋白酶菌株，其中，Halorussussp. XZYJ18胞外蛋白酶酶活最高。XZYJ18在對數(shù)生長后期開始大量合成胞外蛋白酶，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基會抑制蛋白酶的合成。XZYJ18蛋白酶對溫度、pH、鹽度均有較好的耐受性，因而將在高鹽調味品發(fā)酵等工業(yè)過程中具有廣泛的應用潛力。本研究能夠為嗜鹽古菌蛋白酶的大規(guī)模生產以及工業(yè)應用提供一定的理論基礎。