許磊

（天津民祥生物醫(yī)藥股份有限公司 天津 300000）

石斛為蘭科植物馬鞭石斛、鐵皮石斛、環(huán)草石斛、黃草石斛的新鮮或干燥莖，被稱為“九大仙草”之首，為珍稀、名貴、道地中草藥，當(dāng)下多以其總多糖含量的高低來判斷石斛品質(zhì)的優(yōu)劣。本研究以總多糖含量為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗，優(yōu)化并最終確定了石斛總多糖的最佳提取工藝，以期為石斛總多糖的提取工藝研究提供參考和借鑒。

1.材料與試劑

石斛采自安徽省霍山縣，無水葡糖糖、苯酚、硫酸等化學(xué)試劑均為分析級，實(shí)驗用水均為Milli-Q超純水機(jī)制備（密理博（上海）貿(mào)易有限公司）。紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；LC-4016型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；十萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雙層鐵皮電爐（上海日用電爐廠）。

2.方法與結(jié)果

2.1 石斛中總多糖含量的測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，于100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，制成每1mL含90μg/mL的溶液，即得對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取石斛粉末（過三號篩）約0.12g，精密稱定，加水80mL，加熱回流2小時，放冷，轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2mL，置15mL離心管中，精密加入無水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20min，棄去上清液（必要時濾過），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總多糖含量的測定

精密量取供試品溶液1mL，置10mL具塞試管中，精密加入5% 苯酚溶液 1mL，搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2015藥典通則0401），在488nm的波長處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。

總多糖提取率=總多糖質(zhì)量/原藥材的干品重量×100%。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0mL，振搖，精密加入5%苯酚溶液l.0mL（現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光），搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰水浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2015藥典通則0401），在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在9.016～90.160 μg/mL范圍內(nèi)線性良好（y=0.00881x+0.11252，R2=0.99904）。

2.1.5 精密度實(shí)驗

按標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍內(nèi)，精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，各1mL，按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算RSD=2.4%，精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗

在標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍內(nèi)，精密吸取2.1.2項下制備的供試品1mL，分別于0h，2h，4h，6h按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算其RSD=0.88%，穩(wěn)定性良好，符合方法學(xué)要求。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗

在標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的范圍內(nèi)，精密量取2.1.2項下制備的供試品1mL，按照2.1.3項下操作測定吸光度，連續(xù)測定6次，計算RSD=3.2%，重復(fù)性良好，符合方法學(xué)要求。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗

取已知含量的石斛粉末100mg，精密稱定，共六份，分別加入適量的對照品溶液，按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算提取回收率，RSD=3.4%，加樣回收率合格，符合方法學(xué)要求。

2.2 石斛總多糖提取工藝考察

以提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗（表1）。進(jìn)而得到石斛總多糖加熱回流提取的最優(yōu)條件。石斛總多糖最佳提取條件正交實(shí)驗表見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交方差分析

從表3計算結(jié)果可知，石斛總多糖提取效果的因素影響為C＞A＞B＞D，最佳工藝的組合為A1B3C2D2。以極差最小的D因素為誤差項進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示C因素對石斛總多糖提工藝具有顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與成本考慮，選擇A1B3C2D2，即料液比為100:80（mg/mL），提取溫度為100℃，提取時間為2h，提取次數(shù)為2次。

3.討論

通過研究，我們發(fā)現(xiàn)對于石斛的總多糖成分的提取影響因素比較多的是提取時間＞料液比＞溫度＞提取次數(shù)，最終我們得到的結(jié)果是在石斛總多糖的提取過程中應(yīng)優(yōu)先考慮提取時間的影響，綜合其他影響因素，得出最佳具有方便，經(jīng)濟(jì)，有效率的提取工藝。

石斛經(jīng)過加熱回流法提取，最后采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定其總多糖的含量，該方法簡潔、方便、適用性強(qiáng)，用來評價石斛質(zhì)量的優(yōu)劣，具有重要的的意義。對于石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有巨大的促進(jìn)意義。