席云清 戚瑞榮 田佳鑫 張會(huì)軍 雷 燕 唐紹林 王桂芹

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118; 2. 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣州 510515;3. 廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東 510515)

虹彩病毒科(Iridovirus)病毒是雙鏈DNA病毒,病毒粒子為正二十面體。該病毒科包括5個(gè)病毒屬,其中3個(gè)屬: 細(xì)胞腫大屬虹彩病毒(Megalocytivirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)主要感染魚(yú)類、兩棲類等低等脊椎動(dòng)物[1]。細(xì)胞腫大病毒相對(duì)來(lái)說(shuō)是一個(gè)新的家庭成員, 目前已被分離鑒定的種類繁多, 其中傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)已被我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1125號(hào)列為二類動(dòng)物疫病, OIE將同病毒屬的真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)列為必須申報(bào)的疾病。該屬病毒具有廣泛的宿主范圍, 嚴(yán)重影響了包括真鯛(Pagrus major)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、鱖(Siniperca chuatsi)、石斑魚(yú)(Epinephelussp)、云斑尖塘鱧(Oxyeleotris marmoratus)、大口黑鱸(Micropterus salmoides)在內(nèi)的眾多養(yǎng)殖魚(yú)類[2—7]。并且該屬病毒可導(dǎo)致高死亡率, 給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此已成為目前感染魚(yú)類的重要病原之一。

眼斑擬石首魚(yú)(Sciaenop socellatus)又稱美國(guó)紅魚(yú)、紅擬石首魚(yú)、紅鼓魚(yú)、黑斑紅鱸、斑點(diǎn)尾鱸等, 屬鱸形目, 石首魚(yú)科, 擬石首魚(yú)屬[8], 該魚(yú)原產(chǎn)于美國(guó)東南海岸, 我國(guó)臺(tái)灣和青島分別于1987年和1991年引進(jìn)此魚(yú), 目前已在我國(guó)南方及北方部分地區(qū)大面積養(yǎng)殖[9]。該魚(yú)肉質(zhì)鮮美, 口感和觀感俱佳,且具有生長(zhǎng)快、病害少, 廣溫、廣鹽等優(yōu)點(diǎn), 早在美國(guó)成為重要的養(yǎng)殖種類, 現(xiàn)如今已成為世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量很高的海水養(yǎng)殖種類之一。2010—2017年,廣東省珠海市池塘養(yǎng)殖的眼斑擬石首魚(yú)每年大約在6—10月期間開(kāi)始陸續(xù)大面積發(fā)病, 病魚(yú)主要癥狀為體色變?yōu)殂y黑色, 鰭基出血, 鰓絲貧血并有出血點(diǎn)、脾臟腫大。內(nèi)服各種抗菌藥物治療無(wú)效, 外用刺激大的消毒、殺蟲(chóng)藥物治療后死亡數(shù)劇增, 嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)90%, 給養(yǎng)殖業(yè)者造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

本文通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、癥狀觀察, 結(jié)合病原學(xué)檢測(cè)、病理學(xué)以及分子生物學(xué)診斷技術(shù), 分析廣東省珠海市眼斑擬石首魚(yú)養(yǎng)殖池塘發(fā)病的原因, 確定眼斑擬石首魚(yú)發(fā)病的病原。

1 材料與方法

1.1 材料

患病魚(yú)取自廣東省珠海市典型眼斑擬石首魚(yú)發(fā)病養(yǎng)殖池塘, 共取20尾發(fā)病瀕死魚(yú), 并取10尾健康魚(yú)作對(duì)照。

95%酒精, 100%酒精, 波恩氏液, 2×Taq PCR Master Mix, 2216E、腦心浸液瓊脂(BHI)和普通培養(yǎng)基(TSA)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

流行病學(xué)調(diào)查和癥狀觀察調(diào)查發(fā)病魚(yú)的魚(yú)齡、苗種來(lái)源、池塘發(fā)病率、池魚(yú)死亡率和傳染性; 發(fā)病水溫等水質(zhì)理化、生物指標(biāo)和發(fā)病前后天氣變化、水質(zhì)變化情況; 發(fā)病前后的給藥、投喂等與發(fā)病有關(guān)的池塘管理情況。取發(fā)病魚(yú), 置于解剖盤(pán)中, 首先觀察體表有無(wú)異常、寄生蟲(chóng)等, 再解剖觀察各內(nèi)臟組織器官的病變情況, 并做記錄。

寄生蟲(chóng)檢查主要檢查病魚(yú)的鰓絲、血液和內(nèi)臟器官, 參照文獻(xiàn)[10]中的方法, 取少許鰓絲置于載玻片上制作水浸片, 于光學(xué)顯微鏡下觀察有無(wú)寄生蟲(chóng)。推片法制作血涂片, 于光學(xué)顯微鏡下觀察有無(wú)寄生蟲(chóng)。肝臟、脾臟、腎臟和腸道采用壓片法, 于光學(xué)顯微鏡下觀察有無(wú)寄生蟲(chóng)。

細(xì)菌分離鑒定用70%酒精棉球擦拭魚(yú)體,在無(wú)菌條件下, 以平板劃線法從患病魚(yú)的肝、脾、腎、腦等處分離細(xì)菌, 分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h, 觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

組織病理學(xué)觀察分別取病魚(yú)的鰓絲、肝臟、脾臟、腎臟和腸道等組織, 用波恩氏液固定24h, 用70%酒精換液, 之后每隔4h換液一次, 直至溶液無(wú)黃色, 之后用梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸蠟包埋成塊、于石蠟切片機(jī)上切成5 μm蠟帶, 蘇木精-伊紅(HE)染色后, 于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

PCR檢測(cè)檢測(cè)引物使用OIE推薦的檢測(cè)虹彩病毒的特異性引物[11], 上下游引物序列為: P1: 5′-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3′, P2: 5′-GCAC CAACACATCTCCTATC-3′。預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為570 bp, 引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。分別取肝、脾、腎、腸、鰓等組織器官, 研磨后在–20℃下反復(fù)凍融4次, 然后用酚-氯仿法提取組織DNA, 放置在–20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用引物P1和P2, 配制20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng): 無(wú)菌蒸餾水6 μL, 2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, DNA模板3 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃下預(yù)變性5min; 95℃下變性30s,55℃下退火30s, 72℃下延伸30s, 共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸10min, 放置在4℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行回收, 送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司對(duì)回收基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI blast上進(jìn)行片段基因相似性檢索。

主衣殼蛋白序列的測(cè)定和分析參照文獻(xiàn)[12]中的方法, 比對(duì)并合成MCP全長(zhǎng)擴(kuò)增引物, 引物序列為: MCP-F:5′-GGATCCATGTCTGCAATCTCA GGTGCAAACGTAA-3′, MCP-R:5′-CTCGAGCA GGATAGGGAAGCCTGCGGCG-3′。

采用引物MCP-F和MCP-R擴(kuò)增MCP全長(zhǎng)序列,大小約為1300 bp, 下劃線標(biāo)注分別是BamHⅠ和xhoⅠ酶切位點(diǎn), 能保護(hù)PCR產(chǎn)物得完整性, 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 并將純化的產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAstar v7.1分析軟件對(duì)測(cè)序基因序列與NCBI中下載的虹彩病毒代表株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 流行情況及癥狀觀察

該病在該養(yǎng)殖地區(qū)內(nèi)主要發(fā)生于水溫在20—30℃的5—10月, 水溫25—28℃為發(fā)病高峰。發(fā)病魚(yú)規(guī)格全長(zhǎng)一般在10 cm以上。在正常情況下死亡率較低, 約5%—30%, 當(dāng)有藥物刺激或投喂量大、水質(zhì)劇烈變化等其他應(yīng)激因素時(shí)日死亡量迅速增加, 有些發(fā)病池塘最后累計(jì)死亡率可達(dá)90%。多數(shù)池塘是在適宜水溫范圍內(nèi)受到強(qiáng)烈應(yīng)激后池魚(yú)發(fā)病或注入未經(jīng)處理的河道水后發(fā)病。

發(fā)病后病魚(yú)上浮、在水面下停滯或漫游; 體型消瘦、體色變?yōu)殂y黑色、兩眼間皮膚褪色、顏色淡紅, 尾鰭基部出血。病魚(yú)鰓絲貧血有出血點(diǎn)。解剖見(jiàn)脾臟腫大, 肝臟貧血發(fā)白, 腎臟腫大(圖1)。在鰓、肝、脾、腎、腸等組織或器官中未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲(chóng)。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

將30尾眼斑擬石首魚(yú)的肝、脾、腎臟分別接種于普通培養(yǎng)基, 恒溫培養(yǎng)24h后均未見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)。

2.3 組織病理變化

組織切片顯示, 患病眼斑擬石首魚(yú)的肝、脾、腎、腸組織均發(fā)生了不同程度的病變, 且在肝、脾、腎、腸組織中均可見(jiàn)感染虹彩病毒后的特征性病變-直徑約為20—30 μm形態(tài)異常的嗜堿性腫大細(xì)胞(圖2)。

健康魚(yú)肝細(xì)胞為多邊形, 排列均勻有規(guī)則(圖2A)?；疾◆~(yú)肝組織輕度脂肪變性, 輕微淤血, 肝細(xì)胞界限不明, 可見(jiàn)零星腫大細(xì)胞(圖2B)。

健康魚(yú)脾實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要由大量的淋巴細(xì)胞、紅血細(xì)胞及其數(shù)量不等的單核細(xì)胞等組成(圖2C)?；疾◆~(yú)脾組織中可見(jiàn)多個(gè)腫大細(xì)胞, 脾實(shí)質(zhì)細(xì)胞散在壞死, 細(xì)胞核固縮, 散布少量黑色素巨噬細(xì)胞中心(圖2D)。

健康魚(yú)腎由泌尿組織和淋巴組織構(gòu)成, 泌尿組織部分可見(jiàn)腎小球和腎小管, 腎小管上皮細(xì)胞為立方狀或長(zhǎng)方狀, 細(xì)胞核位于細(xì)胞中部(圖2E)?；疾◆~(yú)的腎間組織細(xì)胞散在有壞死, 且可見(jiàn)多個(gè)腫大細(xì)胞(圖2F)。

健康魚(yú)腸組織結(jié)構(gòu)一般有4層: 黏膜層、固有層、肌層和漿膜層, 組織輕微淤血(圖2G)。患病魚(yú)腸固有層可見(jiàn)腫大細(xì)胞, 且有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2H)。

圖1 病魚(yú)解剖特征Fig. 1 Characteristics of diseased fish

2.4 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

分別以發(fā)病魚(yú)和健康魚(yú)組織DNA作為模板, 采用特異性引物P1和P2通過(guò)PCR方法進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)病魚(yú)可以擴(kuò)增出570 bp左右的特異性條帶, 與預(yù)期大小符合, 而健康魚(yú)無(wú)任何擴(kuò)增條帶。

2.5 MCP序列分析

將測(cè)得的核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì), 結(jié)果表明與已報(bào)道的細(xì)胞腫大屬的真鯛虹彩病毒(RSIV)同源性最高約為99.2%, 與斜帶石斑魚(yú)虹彩病毒(OSGIV)同源性為97.9%, 與傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)同源性為93.5%。另外從GenBank中查找虹彩病毒MCP相關(guān)序列, 包括蛙病毒屬(Ranavirus)代表株: 蛙病毒(FV3)、虎紋蛙病毒(TFV); 淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)代表株:淋巴囊腫病病毒中國(guó)株(LCDV-C)、淋巴囊腫病病毒1型(LCDV-1)。分析了MCP基因測(cè)序結(jié)果, 其核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明: 測(cè)序得到的MCP序列(S. ocellatusIridovirus, SOIV, 暫未提交NCBI)與細(xì)胞腫大屬虹彩病毒聚為一簇。所以判定從眼斑擬石首魚(yú)檢測(cè)到的病毒應(yīng)為細(xì)胞腫大屬虹彩病毒。

3 討論

本研究通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、癥狀觀察、細(xì)菌學(xué)診斷、病理學(xué)診斷以及分子生物學(xué)診斷, 確定引起廣東珠海地區(qū)池塘養(yǎng)殖眼斑擬石首魚(yú)并大量死亡的病因是感染了細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒。目前細(xì)胞腫大屬虹彩病毒在其他種屬魚(yú)類中已有大量報(bào)道, 但在眼斑擬石首魚(yú)中屬首次報(bào)道。

圖2 眼斑擬石首魚(yú)組織病變情況Fig. 2 The pathological changes of the tissue of Sciaenops ocellatus

目前報(bào)道眼斑擬石首魚(yú)感染較多的疾病是細(xì)菌性疾病, 如海藻希瓦氏菌、海豚鏈球菌、哈維氏弧菌、燦爛弧菌等[13—16], 感染細(xì)菌的癥狀基本上表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腐爛、爛鰓、肝臟糜爛; 此外渦蟲(chóng)感染的寄生蟲(chóng)病也有相關(guān)報(bào)道[17], 而感染渦蟲(chóng)的癥狀主要是爛鰓、鰓絲分泌大量黏液及增生組織將其包裹。本研究中發(fā)病眼斑擬石首魚(yú)的癥狀主要表現(xiàn)為體色發(fā)黑、鰓絲貧血和肝脾腎臟器腫大, 這與以上研究者報(bào)道的細(xì)菌和渦蟲(chóng)感染的癥狀有明顯區(qū)別, 但與李凱彬等[18]報(bào)道的網(wǎng)箱養(yǎng)殖眼斑擬石首魚(yú)感染虹彩病毒的癥狀有類似之處, 如體色變深、鰓絲發(fā)白貧血。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)病魚(yú)有消毒、殺蟲(chóng)藥物刺激或其他應(yīng)激因素時(shí)日死亡量迅速增加, 這與病毒病的流行特點(diǎn)相同, 并且通過(guò)對(duì)發(fā)病眼斑擬石首魚(yú)細(xì)菌分離培養(yǎng)與解剖鏡檢排除細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染的可能。通過(guò)對(duì)病魚(yú)的組織病理觀察發(fā)現(xiàn)其變化與真鯛虹彩病毒、鱖傳染性脾腎壞死病毒和云斑尖塘鱧虹彩病毒報(bào)道的情況相似[2,4,12], 可在多個(gè)器官組織病理切片中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞腫大屬虹彩病毒的特征性病變即嗜堿性的腫大細(xì)胞, 從而說(shuō)明該病毒為細(xì)胞腫大屬虹彩病毒的可能性。

圖3 虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 The phylogenetic tree of Iridovirus

為了驗(yàn)證引起該病的病原本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從分子水平展開(kāi)研究。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)OIE推薦的檢測(cè)虹彩病毒的特異性引物[11]對(duì)病魚(yú)進(jìn)行病毒檢測(cè), 結(jié)果在病魚(yú)組織中擴(kuò)增出570 bp大小的特異性條帶, 從而證實(shí)發(fā)病魚(yú)體內(nèi)虹彩病毒的存在。同時(shí)通過(guò)高度保守的虹彩病毒MCP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 可以明確證實(shí)該病毒與細(xì)胞腫大屬虹彩病毒親緣關(guān)系最近, 由此說(shuō)明引起該病的病原為細(xì)胞腫大屬虹彩病毒且與真鯛虹彩病毒同源性較高, 同時(shí)這對(duì)眼斑擬石首魚(yú)池塘養(yǎng)殖過(guò)程中感染的虹彩病毒的分類地位做出比較確切的研究。

在本次對(duì)疾病的診斷過(guò)程中通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)當(dāng)水溫為20—30℃的5—10月該病易發(fā), 且在25—28℃時(shí)達(dá)到發(fā)病高峰。并且當(dāng)魚(yú)規(guī)格全長(zhǎng)一般在10 cm以上時(shí)易發(fā)該病, 因此在該段時(shí)期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的監(jiān)測(cè)力度, 當(dāng)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚(yú)群開(kāi)始發(fā)病時(shí)建議從事漁業(yè)管理人員應(yīng)首先從發(fā)病魚(yú)的癥狀和流行情況上對(duì)該疾病做出相應(yīng)的診斷, 及時(shí)做好初步的補(bǔ)救措施, 如停止喂料, 停止換水等應(yīng)激操作,以期為減少發(fā)病后續(xù)的死亡量。