張 棟 高風英 盧邁新 曹建萌 劉志剛 可小麗 王 淼

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510300;2. 上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

羅非魚(Oreochromisspp.)是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種, 在國民經(jīng)濟中占有重要地位。盡管我國羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速, 但是近年來鏈球菌病的暴發(fā)引起的高死亡率(可達70%), 已嚴重威脅到羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1,2]。因此, 培育羅非魚的抗病品系是預防羅非魚感染鏈球菌的重要途徑之一。然而傳統(tǒng)的育種方法存在選育周期長和優(yōu)良性狀遺傳不穩(wěn)定等缺點。隨著分子標記輔助育種的不斷發(fā)展, 利用分子標記輔助選育, 可以有效地縮短育種周期, 保證選育出的優(yōu)良性狀可以穩(wěn)定遺傳, 從而彌補傳統(tǒng)選育的不足[3]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是第三代DNA分子標記, 是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕擞洝NP標記富有代表性, 遺傳穩(wěn)定性高, 位點豐富且分布廣泛, 檢測快速, 易實現(xiàn)自動化分析等特點決定了其將在分子輔助育種中發(fā)揮著重要作用[4]。目前, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖的很多物種中利用免疫相關(guān)基因進行抗病相關(guān)SNPs標記的篩選[5—12]。

魚類中的免疫系統(tǒng)是防御病原體入侵的有效武器, 免疫系統(tǒng)分為非特異性和特異性免疫。MHC基因作為特異性免疫與非特異性免疫之間的橋梁, 在魚類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[13]。β2-微球蛋白是一種大約12 kD的可溶性小蛋白, 廣泛存在細胞核表面, 在機體中含量穩(wěn)定, 是一種含有免疫球蛋白基序的免疫球蛋白超家族成員[14]。其作為MHCⅠ類分子的重要組成部分, 是主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ分子的亞基之一[14,15]。輕鏈分子β2m與重鏈分子MHCⅠ類(α鏈)通過非共價鍵形成穩(wěn)定的異二聚體[16]。β2m還能夠影響T-淋巴細胞受體(T-lymphocyte receptors, TCR)與MHC抗原肽復合物結(jié)合[17], 并且參與T細胞激活[18]。此外,β2m通過直接接觸NK細胞抑制受體來進行調(diào)節(jié)NK細胞功能[19,20]。在人類和小鼠中β2m基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子[21], 然而在硬骨魚類中含有3個外顯子和2個內(nèi)含子并且相對于哺乳動物和鳥類減少了2—3氨基酸殘基[22]。目前草魚(Ctenophayngodon idellus)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鮭(Salmo salar)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的β2m基因都已有研究報道[23—27]。

鑒于上述研究背景, 利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù),研究羅非魚免疫相關(guān)基因的作用機制, 篩選出與羅非魚抗病相關(guān)的分子標記, 實現(xiàn)羅非魚抗性優(yōu)良品種的培育, 對于羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康的持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本團隊前期成功分離了尼羅羅非魚β2m的cDNA及基因組序列, 并利用定量PCR檢測了該基因在健康個體中的組織分布和感染鏈球菌以后該基因在各組織中表達的變化, 發(fā)現(xiàn)β2m基因在尼羅羅非魚抗鏈球菌感染過程中發(fā)揮重要作用[27]。因此, 本研究以尼羅羅非魚β2m基因為研究對象, 篩查其具有的SNP位點, 并通過SNPs與鏈球菌抗性及易感性狀的關(guān)聯(lián)分析, 篩選出與尼羅羅非魚抗鏈球菌病相關(guān)SNP位點及單倍型, 為利用該分子標記進行羅非魚抗病輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品采集實驗中所用尼羅羅非魚的抗病群體和易感群體均來源于中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所高要水產(chǎn)種質(zhì)中心。

對2011年建立的20個家系的尼羅羅非魚進行無乳鏈球菌感染, 感染后7d之內(nèi)死亡的個體視為易感個體, 3個月之后仍存活的, 視為抗病個體。并將存活下來的魚作為抗病選育基礎(chǔ)群P0代繁殖構(gòu)建F1代。

β2m基因與無乳鏈球菌抗性/敏感性狀關(guān)聯(lián)分析所用的抗性/易感尼羅羅非魚的獲得: 從F1代每個家系中均選90尾個體大小相近的健康尼羅羅非魚平均分配到3個0.5 m3的充氣水箱中, 20個家系共1800尾魚。馴養(yǎng)2周后進行無乳鏈球菌人工感染實驗(感染濃度為1×107cfu/mL, 每尾注射菌液200 μL),1周內(nèi)死亡的尼羅羅非魚視為易感群體, 而在人工感染無乳鏈球菌實驗中始終存活的尼羅羅非魚視為抗病群體。無乳鏈球菌菌株是WC1535, Ia型強毒株, 由本實驗室分離鑒定并保存。

實驗試劑常規(guī)PCR所用的TaqDNA polymerase、dNTP mixture、Buffer forTaqDNA Polymerase和MgCl2購于上海申能博彩生物科技有限公司; DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司, 瓊脂糖粉(西班牙, Biowest)。

1.2 實驗方法

尼羅羅非魚基因組DNA的提取使用TIANamp Marine Animals DNA Kit (天根)試劑盒提取尼羅羅非魚的尾鰭基因組DNA, 參照試劑盒說明書進行提取, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測其濃度和純度, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尼羅羅非魚β2m基因序列SNP位點的篩查從抗病P0代20個家系中選取20尾抗病和20尾敏感個體(每個家系一尾)作為β2m基因序列SNP位點的篩查材料, 根據(jù)β2m基因序列(全長2064 bp)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2對引物, 第1對引物β2m-sf1 (5′-AGTTTAGCTTCGGGAGCAGG-3′)和β2m-sr1 (5′-TGCAGCCGGTACCGGTCCGC-3′), 擴增長度931 bp; 第2對引物β2m-sf2 (5′-GCGGACCG GTACCGGCTGCA-3′)和β2m-sr2 (5′-CGCATA ATAGCCAAGAACCC-3′), 擴增長度1153 bp。PCR反應體系為50 μL: 基因組DNA 1 μL, 4× dNTP mixture 1 μL, 上下游引物(20 μmol/L) 1 μL,TaqDNA polymerase 1 μL, ddH2O 36.5 μL。PCR擴增條件: 94℃預變性3min; 94℃變性30s, 64℃退火30s,72℃延伸60s, 30個循環(huán); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物直接送廣州立菲生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果導入DNAstar軟件進行比對, 篩查SNP位點。

β2m基因序列SNP位點的基因分型根據(jù)已經(jīng)篩選到SNP位點, 從F1代20個家系中隨機選取102尾易感個體和102尾抗病個體尾鰭DNA, 采用snapshot法進行SNP位點基因型分型?；蚍中陀缮虾＝萑鹕锕こ逃邢薰緶y序完成。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用PIC-CALC程序?qū)NP位點的分型結(jié)果計算其多態(tài)信息含量PIC(Polymorphism information content)。利用Popgen 32 軟件計算其觀測雜合度Ho(Observed heterozygosity)、期望雜合度He(Expected heterozygosity)、有效等位基因含量Ne(Effective number of alleles)以及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,H-W)平衡(P＞0.001)。利用SPSS 23.0軟件對SNP位點的基因型和等位基因頻率進行差異性顯著檢驗。采用Haploview 4.2 軟件對β2m序列的SNP位點進行連鎖不平衡分析、標簽SNP (Haplotype tag SNPs, htSNPs)的挑選以及單倍塊的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 β2m基因序列SNP位點及分析

利用設(shè)計的2對引物對P0代的20尾抗病群體和20尾易感群體進行擴增和測序分析, 從β2m基因序列中篩選到30個SNP位點(圖1)。外顯子區(qū)域的SNP2、SNP10-SNP16、SNP18-SNP24位點屬于非同義突變, 其他在外顯子區(qū)域的位點屬于同義突變(表1)。30個SNPs位點中有4個T/C轉(zhuǎn)化位點和10個A/G轉(zhuǎn)化位點, 14個顛換位點和2個插入缺失位點。

圖1 尼羅羅非魚β2m基因組結(jié)構(gòu)及SNP位點分布Fig. 1 Gene structure and polymorphism sites of β2m in O.niloticus

表1 尼羅羅非魚β2m基因外顯子中的SNP位點Tab. 1 The SNPs locus in the exon of β2m in O. niloticus

2.2 β2m基因SNP位點遺傳參數(shù)分析

利用Popgen32軟件對F1代的102尾抗病個體和102尾易感個體的β2m基因序列的30個SNPs基因分型結(jié)果進行多態(tài)性分析(表2)。易感群體的觀測雜合度分布范圍是0.1471—0.549; 期望雜合度的分布范圍是0.1453—0.5023; 易感群體的多態(tài)信息含量的分布范圍是0.1341—0.3749, 其中23個SNPs屬于低度多態(tài)性(PIC＜0.25), 7個SNPs屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5); 有效等位基因含量的分布范圍是1.169—1.9992?？共∪后w的觀測雜合度分布范圍是0.1275—0.4412; 期望雜合度的分布范圍是0.1698—0.4943: 多態(tài)信息含量分布范圍0.1546—0.3709, 其中5個SNPs屬于低度多態(tài)性, 25個SNPs屬于中度多態(tài)性; 有效等位基因含量的分布范圍是1.2033—1.966。利用Popgen32軟件分析表明易感群體和抗病群體的30個SNPs符合哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P＞0.001), 表明30個SNPs具有群體代表性可以進行下一步的連鎖不平衡分析。

2.3 β2m基因SNP位點基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌抗性關(guān)聯(lián)分析

通過SPSS 23.0軟件對β2m基因序列SNP位點的基因型和等位基因頻率進行差異顯著性檢驗, 發(fā)現(xiàn)24個SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率與抗無乳鏈球菌病性狀顯著相關(guān)(表3), 其中SNP1的基因型GG和等位基因G、SNP5的AA和A及SNP6的II和I等24個SNPs的基因型頻率和等位基因頻率與無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)(表3中用下劃線表示,P＜0.05)。 SNP1的基因型CC和等位基因C、SNP5的GG和G及SNP6的DD和D等24個SNPs的基因型頻率和等位基因頻率與無乳鏈球菌抗性性狀顯著相關(guān)(表3中用波浪線表示,P＜0.05)。其中有6個SNPs的基因型頻率和等位基因頻率差異達到極顯著性水平(P＜0.01)(表3)。

2.4 β2m基因SNP位點的單倍型分析及單倍型與無乳鏈球菌抗性關(guān)聯(lián)分析

通過Haploview 4.2 軟件對F1代β2m基因序列的30個SNP位點進行連鎖不平衡 (linkage disequilibrium,LD)分析(圖2)。根據(jù)Wang等四配子檢驗法(Four Gamete Rule)將β2m基因序列的30個SNP位點分為四個單倍塊(圖2)[28]。SNP1和SNP2兩個位點構(gòu)成單倍塊1, SNP3-SNP12構(gòu)成單倍塊2, SNP14-SNP28構(gòu)成單倍塊3, SNP29和SNP30構(gòu)成單倍塊4。單倍塊由幾種單倍型構(gòu)成及各個單倍型的頻率見表4。標簽SNP分析結(jié)果顯示, 單倍塊2中SNP8、SNP9、SNP11、SNP12這4個位點高度連鎖(r2＞0.9), 可選擇其中一個代表另外3個位點; 單倍塊3中的SNP14—SNP26這13個位點彼此之間完全連鎖(r2=1,D=1), 每個位點均可作為單倍塊3的標簽SNP(htSNPs)。

利用Haploview 4.2軟件分析得出單倍型H-1-1、H-2-1、H-3-2和H-4-2與無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)(P＜0.05), 單倍型H-1-3、H-2-3、H-3-3和H-4-1與無乳鏈球菌的抗性性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)(表4)。

表2 30個SNP位點在尼羅羅非魚易感群體和抗病群體的遺傳信息Tab. 2 The genetic polymorphism information of 30 SNPs in the susceptible group and resistant group in O. niloticus

3 討論

目前, 鏈球菌病是導致羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量降低的主要病害, 培育羅非魚的抗病品系可以有效的防止鏈球菌病的侵害, 本團隊在前期發(fā)現(xiàn)通過篩選與抗病相關(guān)的SNP位點可以加速選育抗病品系的進程。在本研究中從β2m基因序列中共篩選出30個SNP位點, 1個SNPs位于5′UTR, 17個SNPs位于外顯子區(qū)域其中16個非同義突變位點, 一個同義突變位點, 9個SNPs位于內(nèi)含子區(qū)域, 4個SNPs位于3′UTR。雖然位于內(nèi)含子區(qū)域的SNP位點并不編碼蛋白和直接進行表達, 但是可以影響基因的表達效率[29]。多項研究也表明內(nèi)含子對多種哺乳動物中的基因表達有顯著的積極作用[30,31]。因為內(nèi)含子通過剪切從而影響mRNA代謝的幾乎所有過程, 所以內(nèi)含子對基因的表達調(diào)控具有重要作用[32]。非編碼區(qū)的SNP位點可能在轉(zhuǎn)錄水平上影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、剪接位點等功能位點, 而編碼區(qū)的SNP可引起氨基酸變化并改變翻譯的蛋白質(zhì)的功能或結(jié)構(gòu)性質(zhì)[33]。同義突變的SNP位點并不改變編碼的氨基酸序列, 但是同義突變可能影響少數(shù)密碼子共翻譯折疊時間, 從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[34,35]。本研究中外顯子區(qū)域的同義突變位點和內(nèi)含子區(qū)域中3個SNP位點與無乳鏈球菌的抗性顯

著相關(guān)。多項研究證明, 內(nèi)含子區(qū)域和外顯子區(qū)域的同義突變的SNP位點和抗病相關(guān)。Fu等[6]在羅非魚中發(fā)現(xiàn)MCP-8基因內(nèi)含子區(qū)域的SNP1的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌的抗性顯著相關(guān), 在亞洲海鱸的LECT2基因發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子區(qū)域的SNP2位點等位基因在感染大腹部病(Big belly disease)的抗病群體和易感群體中的分布頻率存在顯著差異[10]。Pant等[36]發(fā)現(xiàn)牛(Bovine)的PGLYRP1基因外顯子區(qū)域的同義突變位點SNP c.480G＞A與感染MAP(Mycobacterium aviumssp.paratuberculosis)的易感性狀顯著相關(guān)。β2m基因序列外顯子區(qū)域SNPs較多,這與Fu等[6]在羅非魚的MCP-8基因中發(fā)現(xiàn)的SNPs類似。SNP位點的He、Ho、Ne和PIC反應的是該位點遺傳多樣性高低的一個指標。本研究發(fā)現(xiàn)易感群體中7個位點屬于中度多態(tài)水平, 抗病群體中25個位點屬于中度多態(tài)水平, 從而表明F1代尼羅羅非魚的抗病群體保持了較高的遺傳多樣性, 可以用于后續(xù)的品種選育[37]。

表3 尼羅羅非魚β2m基因在易感群體和抗病群體的SNPs統(tǒng)計分析Tab. 3 The SNPs distributions in both susceptible group and resistant group of β2m in O. niloticus

續(xù)表3

圖2 尼羅羅非魚β2m基因SNPs連鎖不平衡分析Fig. 2 Linkage disequilibrium map of pair-wise LD between the SNPs of β2m in O. niloticus

表4 尼羅羅非魚β2m基因單倍型與抗無乳鏈球菌感染的關(guān)聯(lián)分析Tab. 4 Association of β2m haplotypes with the resistance to S. agalactiae in O. niloticus

本研究結(jié)果顯示30個位點構(gòu)成4個單倍塊和14種單倍型, 其中單倍塊2的4個SNP位點和單倍塊3中的13個SNP位點各自彼此之間高度連鎖(r2＞0.9),單倍塊2的4個SNP位點中的任何一個, 均可代表另外3個位點; 單倍塊3中的任何一個SNP位點均可作為單倍塊3的htSNPs, 發(fā)現(xiàn)的htSNPs使我們對30個SNPs的研究減少到15個, 本研究從F1代β2m基因序列中篩選到24個SNPs的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌抗性/易感性狀顯著相關(guān), 這24個位點包括單倍塊2和單倍塊3的2個htSNPs。 htSNPs的出現(xiàn)不僅大大減少了我們后續(xù)檢測與抗病群體顯著相關(guān)的SNP位點, 而且使我們對整個基因組序列的單倍塊和單倍型有了更深一步的了解[38]。到目前為止在羅非魚的補體C9基因中發(fā)現(xiàn)2個SNPs[39],duodenase-1 基因中發(fā)現(xiàn)4個SNPs[7],MCP-8基因中發(fā)現(xiàn)3個SNPs與無乳鏈球菌無乳鏈球菌抗性/易感性狀顯著相關(guān)[6]。單倍型作為被染色體重組熱點打斷的區(qū)域, 相對與單個SNP分析提供更多的遺傳關(guān)聯(lián)依據(jù), 為與疾病的關(guān)聯(lián)分析研究提供了新的思路[40]。本研究從14個單倍型中發(fā)現(xiàn)其中4個單倍型與無乳鏈球菌抗性性狀顯著相關(guān), 4個單倍型無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過對F1代尼羅羅非魚β2m基因的SNPs篩選中發(fā)現(xiàn)24個SNPs的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌抗性/易感性狀顯著相關(guān), 以及2個ht-SNPs。單倍型H-1-3、H-2-3、H-3-3和H-4-1 (與無乳鏈球菌抗性性狀顯著相關(guān)(P＜0.05); 單倍型H-1-1、H-2-1、H-3-2和H-4-2與無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)。上述β2m基因分子標記為輔助羅非魚抗病選育提供了基礎(chǔ)研究資料, 對加快羅非魚抗病品系的培育具有重要意義。