岳華梅 葉 歡 阮 瑞 劉志剛 李創(chuàng)舉

(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223)

G蛋白偶聯(lián)受體54 (GPR54)為Kisspeptin (由kiss-1基因編碼)的天然受體, 因此也被稱為Kiss1r(Kiss-1 receptor), 最先在大鼠(Rattus norvegicus)中被鑒定出來[1]。GPR54突變將導致小鼠(Mus musculus)喪失生殖功能, 并引發(fā)低促性腺激素性功能減退癥[2,3]。此外, 敲除小鼠kiss或gpr54均對下丘腦-垂體-性腺軸(BPG軸)功能造成嚴重影響, 從而確立了kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在脊椎動物生殖調控中的重要地位[4—6]。隨后的研究發(fā)現(xiàn), Kisspeptin可通過激活促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)神經(jīng)元的下丘腦通道, 刺激促性腺激素(Gonadotropin, GTH)的分泌, 進而控制生殖軸的各種生理活動[7—9]。Parhar等[10]在羅非魚(Oreochromis mossambicus)中首次報道了gpr54和gnrh神經(jīng)元中存在共表達, 為Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)通過作用于GnRH參與魚類生殖調控和青春期啟動提供了第一證據(jù)。此后, 在軍曹魚(Rachycentron canadum)、鯔魚(Mugil cephalus)、斑馬魚(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)等魚類中相繼發(fā)現(xiàn)了GPR54基因的存在[11—14]。進一步的功能分析證明,GPR54可通過與配體Kisspeptin相結合參與魚類的青春期啟動調控、性類固醇激素對促性腺激素的正負反饋調控、雌性動情周期的分子調控及季節(jié)繁殖活動調控等[15,16]。

達氏鱘(Acipenser dabryanus)隸屬于鱘形目, 為我國特有的淡水定居型魚類, 主要分布于金沙江下游和長江上游。由于水利水電工程建設、航運、水體污染和過度捕撈等人類活動的影響, 達氏鱘生存環(huán)境遭到嚴重破壞, 物種處于極度瀕危狀況, 已于1988年被列為國家一級保護動物[17]。達氏鱘規(guī)?；斯し敝臣夹g雖已突破, 但是人工養(yǎng)殖達氏鱘仍然面臨初次性成熟時間長、雌雄發(fā)育不同步等問題, 限制了其物種資源恢復。為了研究達氏鱘生長生殖的調控機制, 我們通過在飼料中外源添加生長激素GH及促性腺激素FSH飼喂不同年齡的達氏鱘, 結果顯示一定劑量的GH添加可提高魚體肝和肌肉中蛋白質、水分含量, 降低脂肪含量[18], 而FSH添加則可促進二齡達氏鱘精巢的發(fā)育[19]。本研究旨在克隆得到在達氏鱘生殖發(fā)育中發(fā)揮重要功能的gpr54基因, 分析其序列特征和系統(tǒng)進化關系, 研究其組織表達特征。另外, 通過Kisspeptin多肽注射研究Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)對下丘腦中gnrh基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗魚取自中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所太湖試驗場(湖北荊州), 為全人工繁殖的子二代達氏鱘。組織表達分析所選達氏鱘為3齡(雌、雄各1尾), 分別取心、肝、脾、腎、腸、性腺、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦組織,RNAlater(Qiagen)保存液浸泡, 4℃保存過夜后存放于–80℃?zhèn)溆?。Kisspeptin多肽注射實驗所選達氏鱘為9月齡(300±5) g。

1.2 總RNA提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

采用RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(QIAGEN,德國)進行組織總RNA的提取; 參照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)試劑盒合成單鏈cDNA用于qRT-PCR。達氏鱘下丘腦SMART cDNA合成參考Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit操作手冊。

1.3 達氏鱘gpr54基因全長cDNA克隆及序列分析

根據(jù)實驗室已有的達氏鱘下丘腦轉錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 搜索得到gpr54基因2個亞基的序列片段信息, 分別設計引物進行PCR擴增, 產(chǎn)物純化后連入pMD19-T載體, 轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α), 挑取陽性克隆進行測序驗證。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。根據(jù)測序所得序列設計特異引物擴增得到gpr54-1和gpr54-2 cDNA的5′端和3′端, 并進行克隆測序驗證。利用DNAStar軟件中SeqMan對獲得的片段進行拼接, NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所得序列進行比對, NCBI Conserved Domain Database對所得序列進行結構域預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)。應用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)對推導的氨基酸序列與其他脊椎動物進行序列一致性比對, 并利用MEGA 6.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)生樹, 自展法(Bootstrap)檢驗系統(tǒng)分支的置信度(重復次數(shù)為1000)。

1.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)所得到達氏鱘gpr54 cDNA序列設計定量引物(表1), 以所取3齡達氏鱘的各部分組織及多肽注射處理所取下丘腦組織的cDNA為模板, 進行qRT-PCR反應。達氏鱘gnrh定量PCR引物(gnrh1和gnrh2)設計參考中華鱘gnrh基因序列[20], 擴增后進行序列驗證。實驗按SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書進行操作, 重復3次,以達氏鱘β-actin作為內參基因。擴增反應在Bio-Rad CFX96TM Real Time System儀上進行, 反應程序為95℃預變性10min, 95℃變性15s, 53℃退火15s,72℃延伸15s, 共40個循環(huán)。結果采用2–ΔΔCt分析法進行數(shù)據(jù)分析。

表1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

1.5 Kisspeptin多肽注射

通過在達氏鱘下丘腦轉錄組(未發(fā)表數(shù)據(jù))中進行搜索, 得到達氏鱘kisspeptin基因(kiss-1、kiss-2)包含編碼核心十肽的序列信息, 并進行序列驗證。達氏鱘Kiss-1、Kiss-2核心十肽序列分別為: YN WNSFGLRY及FNFNPFGLRF。核心十肽由生物工程(上海)有限公司合成, 采用分析級HPLC進行純度測定(＞95%)。采用0.7% NaCl溶液對所得多肽干粉進行溶解, 配置成濃度為10 nmol/L和1000 nmol/L的多肽溶液。

30尾9月齡達氏鱘(300±5) g被隨機分為5組, 其中1組為對照組, 另外4組為多肽注射組。達氏鱘經(jīng)0.05% MS-222麻醉后, 分別將10、1000 nmol/L的Kiss-1、Kiss-2多肽溶液經(jīng)腹腔注射入體內, 注射體積為20 μL/g。注射后12h, 分別取每尾魚的下丘腦組織, RNAlater(Qiagen)保存液浸泡, 4℃保存過夜后存放于–80℃?zhèn)溆谩２捎胵RT-PCR對下丘腦中gpr54及gnrh基因的轉錄水平進行檢測。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(Mean±SEM)表示,采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。對各實驗組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 當方差齊性時采用Duncan多重比較分析, 當方差非齊性時采用Dunnet’s T3多重比較分析,P＜0.05表示差異顯著,P≥0.05表示沒有顯著性差異。使用GraphPad Prism 5.0軟件進行制圖。

2 結果

2.1 達氏鱘gpr54基因全長序列擴增及序列分析

本研究克隆得到了達氏鱘2個gpr54基因全長cDNA序列, 分別命名為dsgpr54-1和dsgpr54-2(Gen-Bank登錄號: MH025536和MH025537)。dsgpr54-1的全長cDNA序列為2016 bp, 包含367 bp的5′UTR、編碼379個氨基酸的1140 bp的ORF和509 bp的3′ UTR。達氏鱘dsgpr54-2的全長cDNA序列為1980 bp, 由368 bp的5′ UTR、1140 bp的ORF(編碼379個氨基酸)及472 bp的3′ UTR構成。結構域預測發(fā)現(xiàn), 達氏鱘Gpr54-1和Gpr54-2的氨基酸序列均包含保守的7個跨膜結構域。

將推導的達氏鱘Gpr54氨基酸序列與其他代表性脊椎動物的同源序列進行多重比對, 結果表明,達氏鱘Gpr54-1與爬行類的西部錦龜(Chrysemys picta bellii)及兩棲類的非洲爪蟾(Xenopus laevis)的Gpr54-1序列一致性較高, 均超過70%, 而與幾種真骨魚類的Gpr54-1及其他脊椎動物的Gpr54-2一致性較低, 為58%—65%。達氏鱘Gpr54-2與巴西龜(Trachemys scripta elegans)的同源序列一致性最高(73.02%), 與施氏鱘(Acipenser schrenckii)及熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)同源序列的一致性也較高, 分別為69.66%、69.61%。另外, 達氏鱘Gpr54的7個跨膜結構區(qū)(TMD)較為保守, 與其他物種的跨膜區(qū)序列一致性較高。

運用Mega 6.0軟件構建了基于Gpr54氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1), 果蠅(Drosophila melanogaster)AlstR序列作為外類群, 所得結果與氨基酸多重比對結果一致。達氏鱘Gpr54-1先與爬行類的西部錦龜聚為一支, 然后再與兩棲類的熱帶爪蟾聚為一類。達氏鱘Gpr54-2先與爬行類的巴西龜聚為一支, 然后與施氏鱘及兩棲類的熱帶爪蟾的聚類支再聚為一支。這表明鱘魚Gpr54與四足動物的親緣關系較近。

2.2 達氏鱘gpr54 mRNA的組織表達特征

采用熒光定量PCR法檢測了gpr54 mRNA在達氏鱘各組織(心、肝、脾、腎、腸、性腺、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦)中的表達。dsgpr54-1在性腺(精巢、卵巢)及腦組織(下丘腦、垂體、端腦、中腦)中有分布, 且在下丘腦中轉錄水平最高。而dsgpr54-2只在腦組織中轉錄, 且在垂體、下丘腦及延腦中表達豐度都較高(圖2)。

2.3 Kiss多肽注射對下丘腦中gpr54及gnrh基因表達的影響

圖1 采用MEGA 6.0軟件構建的基于Gpr54氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 1 NJ phylogenetic tree based on Gpr54 amino acid sequences by MEGA 6.0

與對照相比, 不同濃度Kiss-1、Kiss-2注射均引起下丘腦中dsgpr54-1和dsgpr54-2表達量升高, 并且10 nmol/L Kiss-2注射能夠顯著促進dsgpr54-2的表達(P＜0.05)(圖3A)。另外, 不同濃度Kiss-1注射造成了dsgnrh1和dsgnrh2轉錄水平的下降, 但是差異都不顯著(P＞0.05)。而不同Kiss-2注射對2個gnrh基因的表達影響完全相反(圖3B)。10 nmol/L Kiss-2注射使得dsgnrh1表達量上升,dsgnrh2的表達量下降; 1000 nmol/L Kiss-2注射則引起dsgnrh1表達量的下降,dsgnrh2的表達量沒有顯著變化(圖3B)。上述研究結果表明, 達氏鱘gpr54-1和gpr54-2均能與其配體kiss-1、kiss-2相結合, 但kiss-2更傾向于與gpr54-2相結合。Kiss-1、Kiss-2通過與Gpr54相結合, 調控下丘腦中gnrh基因的表達, 且其調控功能存在差異。

3 討論

3.1 達氏鱘gpr54基因的序列特征及進化分析

本研究從達氏鱘下丘腦中克隆得到2個gpr54基因, 其氨基酸序列中均包含7個保守的跨膜結構域, 暗示其具有保守的生物學功能。研究表明, 在具有胎盤的哺乳動物(人、鼠)及爬行類中只發(fā)現(xiàn)有一個gpr54基因, 而在哺乳類的鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)中克隆得到2個gpr54基因。迄今為止, 在鳥類中還沒有發(fā)現(xiàn)kiss或gpr54基因的存在[21]。與哺乳動物不同, 在一些真骨魚類(如斑馬魚、青鳉、金魚)、輻鰭魚綱的雀鱔(Lepidosteus platystomus)以及肉鰭魚綱(腔棘魚Coelacanth)中都發(fā)現(xiàn)有2個gpr54基因[22]。基因組共線性分析暗示這些同源基因起源于脊椎動物早期進化中的2次基因組復制[23]。本文在達氏鱘中也鑒定了2個gpr54基因, 根據(jù)氨基酸序列比對及進化樹分析結果推測,其應該為真骨魚類gpr54的直系同源基因。另外氨基酸序列比對結果還發(fā)現(xiàn)達氏鱘Gpr54與四足類(爬行類、兩棲類)的序列一致性高于真骨魚類, 進化樹分析結果進一步證實了此結果。對達氏鱘生長激素GH的氨基酸序列研究也表明其同兩棲類的非洲爪蟾的一致性要高于幾種真骨魚類[24]。這暗示達氏鱘作為一種比較原始的軟骨魚類, 在遺傳上與四足類脊椎動物的親緣關系要近于真骨魚類。

圖2 達氏鱘gpr54基因在不同組織中的表達Fig. 2 The transcription distribution of gpr54 in different tissues of Dabry’s sturgeon

圖3 達氏鱘Kiss-1及Kiss-2核心十肽注射對下丘腦中gpr54(A)及gnrh(B)基因表達的影響Fig. 3 The transcription changes of gpr54 (A) and gnrh (B) genes in the hypothalamus of Dabry’s sturgeon by decapeptide injection of Kiss-1 and Kiss-2

3.2 達氏鱘gpr54基因的組織表達特征分析

在不同的脊椎動物中,gpr54基因具有不同的組織表達特征。黑頭呆魚(Pimephales promelas)及星點東方鲀(Takifugu niphobles)的gpr54基因只在性腺以及腦中有表達[25,26]。金魚的gpr54基因除了在腦及性腺中有轉錄外, 在脂肪等外周組織中也發(fā)現(xiàn)有表達[27,28]。斑馬魚[29]、青鳉[30]、海鱸(Lateolabrax japonicus)[21]、塞內加爾鰨(Solea senegalensis)[31]及大西洋比目魚(Hippoglossus hippoglossus)[32]等魚類中也發(fā)現(xiàn)gpr54基因在腦組織中大量表達。本文對達氏鱘的研究顯示,dsgpr54-1只在腦和性腺中有轉錄, 且在腦中表達量高于性腺, 而dsgpr54-2在腦中特異表達(圖2)。本文的研究結果與上述魚類中的結果較為一致, 這進一步印證了gpr54基因對魚類生殖活動調控的重要功能。另外, 與青鳉中的研究結果類似[30], 達氏鱘dsgpr54-1及dsgpr54-2在下丘腦中具有較高轉錄水平, 這暗示其可能參與調控下丘腦中GnRH神經(jīng)元的功能。

3.3 Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)對GnRH的調控功能分析

Kisspeptin多肽注射是研究Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)對生殖調控影響的重要途徑。在金魚中, 2種kisspeptin的核心十肽均能有效地結合2種Gpr54, 激活受體下游信號, 但表現(xiàn)出一定的受體-配體選擇性差異, 即Kiss-1對Gpr54a的結合更為敏感, 而Kiss-2則主要與Gpr54b相結合, 激活其下游的SRE、CRE信號[33]。在本文的研究中, 達氏鱘Kiss-1及Kiss-2核心十肽注射均能引起下丘腦中dsgpr54-1及dsgpr54-2轉錄水平的升高, 但是10 nmol/L Kiss-2注射能夠顯著促進dsgpr54-2的表達(圖3A)。這表明達氏鱘的kiss基因對gpr54受體的結合也具有偏好性,kiss-2更傾向于與gpr54-2相結合。

另外, 在黑頭呆魚中kisspeptin-10注射可引起gnrh3 (hypophysiotropicgnrhtype, 促垂體型gnrh)基因表達量顯著上升, 而gnrh2表達沒有顯著變化[25]。在斜帶石斑魚中, Kiss2-10注射可引起雌魚gnrh1 (促垂體型)的表達上升, 而gnrh3的表達不受影響[34]。在本文中, 10 nmol/L Kiss2-10注射也引起達氏鱘下丘腦中gnrh1 (促垂體型)的轉錄水平上升(圖3B), 這與上述結果較為一致。但是, 當Kiss2-10注射濃度提高至1000 nmol/L時,gnrh1的表達量反而下降, 這說明當體內Kiss2濃度過高時, 可能引起了達氏鱘魚體的應激反應, 抑制gnrh1的表達。盡管達氏鱘Kiss多肽注射均可引起gnrh1及gnrh2轉錄水平的變化, 但是差異都不顯著(圖3B)。這可能是由于達氏鱘初次性成熟年齡較長, 導致群體間的發(fā)育存在差異, 因此每組只選取6條作為試驗魚, 樣本量偏少。盡管如此, 本文的結果仍然說明達氏鱘Kiss-1及Kiss-2對gnrh基因表達的影響存在差異, 這暗示2種kiss基因對gnrh存在不同的調控作用。