馬冬梅 蘇換換 朱華平 黃樟翰

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

鯉(Cyprinus carpio)具有生長(zhǎng)快、雜食性、抗病力強(qiáng)和味道鮮美等特點(diǎn), 作為世界上重要的養(yǎng)殖魚(yú)類之一, 其產(chǎn)量約占全球淡水養(yǎng)殖魚(yú)類產(chǎn)量的14%, 在世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位。鯉在我國(guó)的養(yǎng)殖歷史悠久, 目前依然是我國(guó)的主要養(yǎng)殖對(duì)象, 2016年鯉養(yǎng)殖總產(chǎn)量為3.5×109kg, 相比2015年增產(chǎn)4.17%, 位于淡水魚(yú)類養(yǎng)殖產(chǎn)量的第3位[1]。華南鯉(Cyprinus carpio rubrofuscus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鯉屬(CyprinusLinnaeus), 為鯉的4個(gè)亞種之一, 分布于珠江流域以及海南島等華南地區(qū)[2,3]。目前, 華南鯉作為優(yōu)質(zhì)的地方鯉魚(yú)品種在華南地區(qū)特別是在粵西、北地區(qū)作為名特優(yōu)水產(chǎn)品種“禾花鯉”進(jìn)行稻田養(yǎng)殖, 因其肉質(zhì)細(xì)嫩, 味道鮮甜, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 深受廣大消費(fèi)者的青睞, 是當(dāng)?shù)匕l(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)一條重要途徑和主導(dǎo)產(chǎn)業(yè), 也為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,特別是提高山區(qū)農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)收入、脫貧致富做出了重要的貢獻(xiàn)。

但長(zhǎng)期以來(lái), 華南鯉地方養(yǎng)殖品種都沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的選育和提純復(fù)壯, 目前用于養(yǎng)殖的種苗大多來(lái)自于野生群體的繁育后代。經(jīng)過(guò)連續(xù)多代的人工繁殖, 特別是大部分養(yǎng)殖戶還依靠自養(yǎng)自繁的方式來(lái)獲得魚(yú)苗, 魚(yú)種近親繁殖嚴(yán)重, 質(zhì)量得不到保證, 導(dǎo)致華南鯉種質(zhì)退化嚴(yán)重, 生長(zhǎng)速度慢, 抗病抗逆性能差, 成活率低, 致使養(yǎng)殖產(chǎn)量低, 無(wú)法滿足當(dāng)前優(yōu)質(zhì)高效漁業(yè)發(fā)展趨勢(shì)的要求。從2010年開(kāi)始,珠江水產(chǎn)研究所科研人員系統(tǒng)地評(píng)估和研究了華南鯉的種質(zhì)資源現(xiàn)狀, 并開(kāi)展了華南鯉優(yōu)質(zhì)品種的定向選育, 已取得了明顯進(jìn)展, 培育的華南鯉優(yōu)良品種在粵北地區(qū)進(jìn)行了稻田試養(yǎng), 其成活率提高20%以上, 單產(chǎn)提高50%以上, 養(yǎng)殖效益明顯。為了加快華南鯉選育工作的進(jìn)程, 本研究利用微衛(wèi)星技術(shù)分析了4個(gè)連續(xù)選育世代遺傳變異的情況, 了解人工選育對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的影響, 以期為下一步制定育種策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用華南鯉選育世代F1、F2、F3及F4群體均來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地。其中, 基礎(chǔ)群體采自于珠江水系干流之一的西江野生群體和乳源瑤族自治縣當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖品種的混合群體, 從2010年開(kāi)始挑選體型標(biāo)準(zhǔn)、健康、生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)的親魚(yú)建立基礎(chǔ)群, 并利用微衛(wèi)星技術(shù)分析了基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性[其中西江野生群體和乳源養(yǎng)殖群體的平均期望雜合度(He)分別為0.7834和0.6989, 平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.7628和0.6458], 結(jié)果表明基礎(chǔ)群體具有較高的遺傳多態(tài)性。每一代在體長(zhǎng)約10 cm和體重約500 g時(shí)分別進(jìn)行一次選擇, 每代選留2000尾(雌雄比例為1∶1)作為選育親本繁殖下一代。4個(gè)人工選育群體(2012年、2013年、2014年和2015年分別繁育出F1、F2、F3和F4)是在上述基礎(chǔ)群體的基礎(chǔ)上, 以生長(zhǎng)速度為主要選育目標(biāo)性狀, 同時(shí)兼顧體型性狀,采用群體選育方法獲得。每個(gè)世代隨機(jī)選取24尾健康個(gè)體作為試驗(yàn)樣本, 取部分鰭條用于基因組DNA提取, 置于95%的乙醇中固定, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組DNA提取基因組總DNA的提取利用TIANamp Marine Animals DNA Kit (TIANGEN)試劑盒抽提, DNA電泳檢測(cè)質(zhì)量合格后, 用滅菌水調(diào)整濃度為50 ng/μL, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SSR擴(kuò)增及檢測(cè)微衛(wèi)星引物Cca02、Cca06、Cca19、Cca67、Cca72和J58引自于Yue等[4],引物Cca30、Koi29-30、Koi57-58、Koi89-90和Koi115-116引自于David等[5], 引物MFW6、MFW7、MFW13、MFW17和MFW 26引自于Crooijmans等[6]。16對(duì)引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系總體積為20 μL, 其中滅菌水13.9 μL, 10×buffer (2 mmol/L Mg2+) 2.0 μL,25 mmol/L dNTPs 2 μL, DNA模板1.0 μL (50 ng), 引物各0.5 μL, 5 U/μLTaq酶(TaKaRa) 0.1 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5min; 94℃ 30s, 退火 30s(各引物退火溫度及序列見(jiàn)表1), 72℃ 30s, 30個(gè)循環(huán); 72℃10min, 4℃保存。PCR產(chǎn)物采用6% (w/v)的聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳進(jìn)行分離, 常規(guī)銀染法檢測(cè)[7]。

表1 華南鯉16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列及特征Tab. 1 Primer sequences and characteristics of 16 polymorphic microsatellite loci from Cyprinus carpio rubrofuscus used in the present study

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用LabImage (Version 2.7.1)軟件在膠圖上確定等位基因條帶的位置和等位基因的大小。采用Popgene1.31軟件分析等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)[8]以及世代間的遺傳相似性系數(shù)、遺傳距離。多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)利用Cervus 3.0軟件計(jì)算獲得[9]。近交系數(shù)(Fis)和群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)以及每個(gè)位點(diǎn)偏離哈-溫平衡期望值的卡方檢驗(yàn)由FSTAT 2.9.3.2分析軟件統(tǒng)計(jì)獲得[10]。4個(gè)世代的聚類分析圖采用MEGA 5.0軟件中的UPGMA方法構(gòu)建[11]。

2 結(jié)果

2.1 不同世代的遺傳多樣性分析

在4個(gè)連續(xù)選育群體中, 16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都表現(xiàn)出較高的多態(tài)性, 且擴(kuò)增條帶清晰。4個(gè)選育世代共檢測(cè)到99個(gè)不同的等位基因, 但每個(gè)世代檢測(cè)到的等位基因數(shù)不等, 分別為91、79、77和73個(gè),每個(gè)位點(diǎn)平均檢測(cè)到的等位基因數(shù)為6.1875個(gè)。其中, Cca30和Cca72兩個(gè)位點(diǎn)觀察到的等位基因數(shù)最多(10個(gè)), 而Koi29和Koi57兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)最少(3個(gè))(表2)。本實(shí)驗(yàn)分析的4個(gè)選育群體的平均等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均觀測(cè)雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和平均多態(tài)信息含量(PIC)如表3所示。

表2 華南鯉4個(gè)世代在16個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)值Tab. 2 Genetic variability of 4 generations of Cyprinus carpio rubrofuscus at 16 polymorphic microsatellite loci

續(xù)表2

2.2 世代間遺傳變異及分化

F-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表4所示, 在16個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)中, 有13個(gè)位點(diǎn)的近交系數(shù)(Fis)值均為負(fù)值, 另外3個(gè)位點(diǎn)為正值, 表明4個(gè)世代的近交程度較輕。研究數(shù)據(jù)顯示, 4個(gè)選育世代都有一定程度的雜合子缺失, 其中F1—F4雜合子缺失的位點(diǎn)數(shù)分別為6、7、8和5個(gè)。但對(duì)于整個(gè)選育群體來(lái)說(shuō), 有3個(gè)群體-位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失狀態(tài), 13個(gè)群體-位點(diǎn)雜合子處于過(guò)剩狀態(tài)。在整個(gè)選育群體中, 微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化(Fst)值最大為0.2410, 最小值為0.0219, 平均值為0.0681。其中, 表現(xiàn)為遺傳分化程度較弱的位點(diǎn)有5個(gè), 遺傳分化程度中等的位點(diǎn)10個(gè), 遺傳分化程度較大的位點(diǎn)有1個(gè)(表4)。世代間遺傳分化指數(shù)(Fst)配對(duì)比較結(jié)果顯示, F1與F4的遺傳分化指數(shù)值最大(0.081), F3與F4則最小(0.051);相鄰世代間Fst值逐漸變小(F1與F2為0.062, F2與F3為0.058, F3與F4則為0.051), 各世代間配對(duì)Fst比較值處于0.05—0.15[12]。上述結(jié)果表明, 本選育群體在檢測(cè)的16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)上表現(xiàn)出一定的遺傳分化,處于中等水平(表5)。

4個(gè)選育世代間的遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)如表6所示, 選育群體F1和F4的Nei氏無(wú)偏遺傳距離值最大(0.2181), 遺傳相似性系數(shù)最小(0.8041); 選育群體F3和F4遺傳距離最小(0.1258), 遺傳相似性系數(shù)最大(0.8819); 相鄰2個(gè)世代間的遺傳距離逐代減小, 遺傳相似性逐代增大。依據(jù)4個(gè)選育世代間的遺傳距離值, 采用UPGMA法構(gòu)建聚類圖見(jiàn)圖1, 選育世代F3首先與F4匯合成一支, 然后與F2匯成一簇,最后與F1匯在一起。

表3 華南鯉4個(gè)世代的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab. 3 Statistical analysis results of genetic diversity belong to 4 generations of Cyprinus carpio rubrofuscus

表4 華南鯉4個(gè)選育世代16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的F-檢驗(yàn)Tab. 4 F-statistics for 4 generations of Cyprinus carpio rubrofuscus at 16 microsatellite loci

表5 華南鯉4個(gè)世代間Fst值比較Tab. 5 Comparing pairwise values of Fst among 4 generations of Cyprinus carpio rubrofuscus

3 討論

選擇育種是水產(chǎn)優(yōu)良品種培育的有效途徑, 但同時(shí)人工選育也是育種群體遺傳多樣性降低的重要原因之一[13]。通常在人工選擇育種的后期, 選育群體的數(shù)量會(huì)逐漸減少, 近交發(fā)生的機(jī)率增加, 從而導(dǎo)致選育群體的遺傳多樣性指數(shù)降低, 引起目標(biāo)群體種質(zhì)衰退, 對(duì)水域生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性下降, 生長(zhǎng)速度減慢, 抗逆能力差, 最終導(dǎo)致失去開(kāi)發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此, 在水產(chǎn)良種培育過(guò)程中, 維持育種群體的遺傳多樣性, 是種質(zhì)資源持續(xù)利用的前提條件。本研究中的華南鯉選育群體是采用人工選擇育種和雜交育種結(jié)合的方法, 對(duì)基礎(chǔ)育種群體經(jīng)過(guò)連續(xù)多年的繼代選育培育而成。目前選育品系已作為“禾花鯉”在廣東省西部和北部地區(qū)稻田中進(jìn)行試養(yǎng), 與當(dāng)?shù)氐咎镳B(yǎng)殖的“禾花魚(yú)”相比, 生長(zhǎng)速度和養(yǎng)殖成活率表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。因此, 了解人工選育過(guò)程中4個(gè)選育世代的遺傳變異情況,有利于后續(xù)育種策略的制定以及優(yōu)良華南鯉品種的培育。目前, 已有大口黑鱸Cropterus salmoides[14]、大黃魚(yú)Pseudosciaena crocea[15]、易捕鯉Cyprinus carpio[16]、翹嘴鱖Siniperca chuatsi[17]、尼羅羅非魚(yú)Orechromis niloticus[18]和團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala[19]等以及凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei[20]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[21]、池蝶蚌Hyriopsis schlegeli[22]、大珠母貝Pinctada maxima[23]、合浦珠母貝Pinctada fucata[24]、中華鱉Trionyx sinensis[25]、刺參Apostichopus japonicus[26]等水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的選育群體遺傳結(jié)構(gòu)監(jiān)測(cè)研究報(bào)道, 但華南鯉的育種研究方面尚未見(jiàn)類似的報(bào)道。有多項(xiàng)研究表明, 盡管人工選擇壓力在一定程度上會(huì)使得選育群體的遺傳多樣性降低, 引起各選育世代出現(xiàn)遺傳分化, 但一些選育群體依然保持較高的遺傳多樣性水平[15,16,19,20]。在本研究中, 隨著選育世代的增加,4個(gè)人工選育群體的遺傳多樣性逐漸下降, 他們的多態(tài)信息含量(PIC)值分別為0.6577、0.6007、0.5852和0.5834, 均比Bostein等[27]提出的衡量群體基因變異程度中等的標(biāo)準(zhǔn)值(多態(tài)信息含量指標(biāo)值為0.5)高。因此, 本實(shí)驗(yàn)分析的華南鯉經(jīng)過(guò)連續(xù)4代的選育, 群體的遺傳多樣性水平依然較高, 表明該選育群體仍具有較好的選育潛力。

表6 華南鯉F1—F4群體的Nei氏遺傳距離(下三角)及遺傳相似性系數(shù)(上三角)Tab. 6 Nei’s standard genetic distance (below) and genetic identity(above) between F1—F4 generations

圖1 基于Nei氏無(wú)偏遺傳距離的UPGMA進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 An unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) dendrogram for 4 generations of Cyprinus carpio rubrofuscus based on Nei’s unbiased genetic distance

遺傳雜合度是評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性水平的一個(gè)常用的指標(biāo), 表示2個(gè)等位基因在每個(gè)個(gè)體中處于雜合狀態(tài)的概率。從本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看, 4個(gè)連續(xù)選育世代的雜合度呈現(xiàn)逐代降低的現(xiàn)象, 與不同世代多態(tài)信息含量PIC值的變化趨勢(shì)相似, 也與大黃魚(yú)[15]和易捕鯉[16]等選育群體遺傳多樣性變化趨勢(shì)相一致, 表明連續(xù)多代的人工選擇已經(jīng)對(duì)華南鯉選育群體的遺傳多樣性造成了影響。在華南鯉選育過(guò)程中, 為了減少近交概率, 采取了一些措施保證選育群體較高的遺傳多樣性, 選育世代F1的觀測(cè)雜合度(Ho)為0.7943, 到F4降為0.7135, 下降了11.32%, 研究結(jié)果與易捕鯉選育群體觀測(cè)雜合度下降6.9%[16]以及中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[28]觀測(cè)雜合度下降3.5%的微衛(wèi)星檢測(cè)結(jié)果相近, 表明華南鯉經(jīng)過(guò)連續(xù)4代選育其群體還沒(méi)有出現(xiàn)近交及瓶頸效應(yīng)。F-檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示, 在16個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)中, 有3個(gè)位點(diǎn)的近交系數(shù)Fis值為正值, 另外的13個(gè)位點(diǎn)為負(fù)值, 表明4個(gè)選育世代的近交程度較輕, 說(shuō)明了在華南鯉選育過(guò)程中采用的大規(guī)模群體繼代選育的方法是行之有效的, 從而降低了近交概率, 選育群體的遺傳多樣性也保持在較高的水平。但在4個(gè)選育世代中, 依然存在3個(gè)群體-位點(diǎn)處于雜合度缺失狀態(tài), 表明這些位點(diǎn)上可能存在啞等位基因, 這在中國(guó)對(duì)蝦[28]和南美白對(duì)蝦Penaeus setiferus[29]選育群體中也得相似的研究結(jié)果, 有研究者認(rèn)為造成位點(diǎn)雜合度缺失的主要原因之一是由微衛(wèi)星座位中經(jīng)常出現(xiàn)的無(wú)效等位基因引起的[30]。

遺傳分化系數(shù)是評(píng)價(jià)群體間遺傳相似性的指數(shù), 表示群體間的遺傳多態(tài)性水平差異程度。在本研究中, 16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在4個(gè)世代中有5個(gè)位點(diǎn)遺傳分化程度較弱, 10個(gè)位點(diǎn)遺傳分化程度中等, 1個(gè)位點(diǎn)遺傳分化程度較大, 各位點(diǎn)的遺傳分化(Fst)指數(shù)在0.0219—0.2410, 群體總遺傳分化指數(shù)為0.0681(表4), 表明選育群體的遺傳分化程度處于中等水平。通過(guò)世代群體間配對(duì)Fst值比較(表5), F1與F4之間Fst比值最大, 為0.081, 而F3與F4之間Fst比值最小, 為0.051, 隨著選育世代的增加, 遺傳分化系數(shù)在相鄰世代之間相繼減小, 與連續(xù)選育世代等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度等均有所下降的變化趨勢(shì)一致, 說(shuō)明了選育后代的遺傳相似度逐漸提高, 選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)隨著世代的增加而發(fā)生了改變。本研究數(shù)據(jù)顯示, 華南鯉選育世代間的遺傳分化指數(shù)配對(duì)比較值處于0.081—0.051, 依據(jù)Wright等[31]對(duì)遺傳分化指數(shù)的界定標(biāo)準(zhǔn), 本研究分析的選育群體的遺傳分化水平處于中等, 這與“全紅”甌江彩鯉(Cyprinus carpiovar. color)[32]的不同選育世代之間出現(xiàn)較大分化(Fst在0.1588—0.2766)的結(jié)果相比, 通過(guò)4代連續(xù)人工選育導(dǎo)致華南鯉的遺傳多樣性降低的影響程度相對(duì)較弱。4個(gè)選育世代間的遺傳距離和遺傳相似性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, F1與F2、F3、F4的遺傳距離逐漸增大(0.1486—0.2181), 遺傳相似性逐漸縮小(0.8819—0.8041)(表6), 其中以世代F1和F4的遺傳距離最大(0.2181), 世代F3和F4的遺傳距離最小(0.1258), 而F3和F4的遺傳相似性系數(shù)最大(0.8819), F1和F4的遺傳相似性系數(shù)最小(0.8041),研究結(jié)果與Thorp[33]指出同種群體間遺傳相似性在0.8—0.97, 遺傳距離在0.03—0.2的結(jié)論相符, 也與尼羅羅非魚(yú)(O. niloticus)“吉富”品系9代選育群體的遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)分別為0.0581—0.0775和0.9254—0.9435的結(jié)果相似[34], 而與易捕鯉[16]選育4代的遺傳距離和遺傳相似性分析結(jié)果差異較大。經(jīng)過(guò)UPGMA聚類分析構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)直觀地顯示出了各選育世代之間的遺傳相似性, 其中F3和F4的遺傳距離最小, 遺傳相似性最大, 首先匯聚在一起, 然后再相繼與F2、F1聚集。上述結(jié)果表明,隨著人工定向選育工作的推進(jìn), 華南鯉選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)了較為顯著改變。這些研究結(jié)果與選育過(guò)程中目標(biāo)性狀逐漸趨向穩(wěn)定的觀測(cè)結(jié)果相一致, 即通過(guò)對(duì)華南鯉選育后代的表型值進(jìn)行測(cè)量, 分析表明經(jīng)過(guò)多代連續(xù)選育, 選育后代的體型逐漸趨于一致, 體重變異系數(shù)逐漸減小, 充分說(shuō)明了人工選育方法對(duì)華南鯉種質(zhì)提純復(fù)壯和新品種培育的作用明顯。

本研究通過(guò)利用16對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物分析了4個(gè)連續(xù)人工選育華南鯉群體的遺傳結(jié)構(gòu)變化情況, 結(jié)果表明華南鯉經(jīng)過(guò)4代選育后, 雖然遺傳雜合度和遺傳多樣性存在下降的現(xiàn)象, 但遺傳多樣性水平依然較高, 依然具有進(jìn)一步選育的潛力。因此,在后續(xù)的選育過(guò)程中, 可通過(guò)適當(dāng)增加選育親本的數(shù)量, 減少近交發(fā)生的概率以及采用較高的選擇壓力等手段, 培育出在生長(zhǎng)、抗逆等優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀方面具有明顯優(yōu)勢(shì)的適合稻田養(yǎng)殖的新品系。