高嫣妮，李筱莉，崔兆磊，陳巖松，葉 倩，陳 燕

(福建省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科/福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科/福建省腫瘤生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350014)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在我國(guó)屬于危害較重的傳染性疾病之一。用傳統(tǒng)“兩對(duì)半”指標(biāo)的HBsAg和HBeAg不能充分反映HBV病毒感染及其療效，存在很大的局限性。HBeAg陰性的活動(dòng)期肝炎患者越來越多，部分HBeAg陰性患者病毒仍大量復(fù)制，目前認(rèn)為可能是免疫清除不全或HBV前C區(qū)末端發(fā)生變異而引起，該類常為慢性乙型肝炎患者，更易發(fā)生肝硬化及肝癌，預(yù)后較差[1-2]。由于HBV-DNA早于HBV其他血清標(biāo)志物出現(xiàn)，因此HBV-DNA陽(yáng)性常被臨床認(rèn)為是判斷HBV復(fù)制及感染的金標(biāo)準(zhǔn)。但HBV-DNA并不能完全反映靜息期肝細(xì)胞HBV復(fù)制情況，且HBV-DNA檢測(cè)成本高、技術(shù)難度大、操作復(fù)雜、影響因素較多，質(zhì)量控制嚴(yán)格，故其檢測(cè)難以廣泛普及?，F(xiàn)對(duì)HBV感染者進(jìn)行血清乙型肝炎病毒大蛋白(HBV-LP)、HBV-DNA、HBV-M及肝功能等指標(biāo)檢測(cè)，分析與其他指標(biāo)的相關(guān)性，探討HBV-LP用于HBV感染者HBV復(fù)制程度和療效監(jiān)測(cè)的可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2016年12月福建省腫瘤醫(yī)院收治的283例HBV感染者作為觀察組，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第十次全國(guó)傳染病與寄生蟲病學(xué)會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中乙型肝炎病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男179例，女104例，平均年齡(50.4±13.1)歲。選取同期60例健康體檢者作為對(duì)照組。2組研究對(duì)象留取血清標(biāo)本4 mL，―80 ℃凍存?zhèn)溆?。本研究獲得福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和受檢者的知情同意。

1.2儀器與試劑 HBV-LP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量檢測(cè)試劑盒(北京熱景生物技術(shù)有限公司)，HBV-DNA檢測(cè)試劑盒(廣州中山達(dá)安基因有限公司)。ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，安圖酶標(biāo)儀；HBV-M 檢測(cè)試劑盒(英科新創(chuàng)科技有限公司)，帝肯酶免自動(dòng)分析儀；肝功能檢測(cè)試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，羅氏P800生化分析儀。所用試劑均在其有效期內(nèi)。

1.3方法 HBV-M、HBV-LP測(cè)定均采用ELISA法，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBV-LP為S/CO≥1為陽(yáng)性；HBeAb、HBcAb 為S/CO≤1為陽(yáng)性。HBV-DNA定量測(cè)定采用熒光定量(PCR)法，其含量≥500 copy為陽(yáng)性。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)采用化學(xué)發(fā)光法；實(shí)驗(yàn)所有操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.12組研究對(duì)象HBV-LP與HBV-DNA檢出率結(jié)果比較 觀察組HBV-LP檢出率為70.7%(200/283)，HBV-DNA檢出率為56.5%(160/283)，HBV-LP和HBV-DNA總檢出率為79.9%(226/283)，而HBeAg檢出率僅為15.5%(44/283)。血清HBV-LP與HBV-DNA的陽(yáng)性符合率為47.3%(134/283)，陰性符合率為20.1%(57/283)，總符合率為67.5%(191/283)。對(duì)照組血清HBV-LP與HBV-DNA的檢出率均為0。

2.2觀察組HBV-LP與HBV-DNA、肝功能指標(biāo)的相關(guān)性 HBV-LP各孔(S/CO)值與HBV-DNA含量(r=0.464，P=0.000)及HBV-DNA拷貝數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.402，P=0.000)。HBV-LP陽(yáng)性患者的ALT、AST、AFP水平均高于HBV-LP陰性患者(均P<0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示，HBV-LP與ALT、AST、AFP含量均呈正相關(guān)(P<0.05)。HBV-DNA中等程度復(fù)制組(103～106copy/mL)和高復(fù)制組(≥106copy/mL)之間，HBV-LP表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1和圖1、2。

表1 HBV-DNA含量與HBV-LP(S/CO)值的相關(guān)性

圖1 HBV-DNA含量與HBV-LP的相關(guān)性

2.3不同模式的HBV-LP和HBV-DNA檢出率結(jié)果比較

2.3.1“兩對(duì)半”常見模式的HBV-LP和HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較 37例大三陽(yáng)(HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽(yáng)性)患者的HBV-LP檢出率為100.0%(37/37)，而HBV-DNA檢出率為91.9%(34/37)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.240)。219例小三陽(yáng)(HBsAg、HBeAb、HBcAb均陽(yáng)性) 患者的HBV-LP檢出率為66.2%(145/219)，HBV-DNA檢出率為50.2% (110/219)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.498，P=0.001)(其他“兩對(duì)半”模式數(shù)量較少，未作統(tǒng)計(jì))。見表2。

圖2 HBV-DNA拷貝數(shù)與HBV-LP的相關(guān)性表2 “兩對(duì)半”常見模式HBV-LP與 HBV-DNA檢出率結(jié)果比較[%(n/n)]

類別例數(shù)(n)HBV-LP檢出率HBV-DNA檢出率P大三陽(yáng)37100.0(37/37)91.9(34/37)0.240小三陽(yáng)21966.2(145/219)50.2(110/219)0.001

2.3.2HBeAg與HBeAb陽(yáng)性和陰性患者HBV-LP及HBV-DNA檢出率結(jié)果比較 44例HBeAg陽(yáng)性患者HBV-LP和HBV-DNA的檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.241)，陽(yáng)性符合率達(dá)93.2%。239例HBeAg陰性患者的HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.722，P=0.001)，陽(yáng)性符合率為38.9%(93/239)。HBeAg陰性但HBV-DNA陽(yáng)性患者的HBV-LP陽(yáng)性率為78.2%(93/119)，HBeAg陰性患者有59.6%(93/156)為HBV-LP陽(yáng)性而HBV-DNA陰性。226例HBeAb陽(yáng)性的HBV感染者HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.248，P=0.001)。57例HBeAb陰性的HBV感染者HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.363，P=0.243)。見表3。

表3 不同血清標(biāo)志物模式的HBV-LP與 HBV-DNA檢出率結(jié)果比較[%(n/n)]

3 討 論

HBV-LP是HBV病毒的包膜蛋白，空間上具有2種不同跨膜結(jié)構(gòu)，其外側(cè)能與易感細(xì)胞受體結(jié)合，內(nèi)側(cè)能與HBV核殼體膜結(jié)合。HBV-LP包括表面抗原和前S蛋白，PreS1蛋白和PreS2蛋白是HBV Dane氏顆粒和亞病毒顆粒的主要包膜。HBV病毒感染、復(fù)制、預(yù)后過程中，HBV-LP起著至關(guān)重要的作用[2-3]。

本研究結(jié)果表明，HBV-LP在HBV感染血清中較HBV-DNA、HBeAg更敏感，HBV-LP檢出率顯著高于HBV-DNA、HBeAg。ELISA法檢測(cè)HBV-LP相對(duì)表達(dá)量與HBV-DNA含量及拷貝數(shù)之間均存在良好的正相關(guān)性，提示HBV-LP表達(dá)與病毒的復(fù)制密切相關(guān)。本研究26例HBV-LP陰性而HBV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本，可能與PCR技術(shù)的高靈敏度有關(guān)[4]。還有66例HBV-DNA陰性而HBV-LP陽(yáng)性標(biāo)本，與HBV-LP的生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)。原因如下，(1)HBV-LP具有雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：HBV-LP較早釋放進(jìn)入血液，感染早期可作為受體蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒粒子的細(xì)胞內(nèi)攝入；在感染中后期則明顯增加參與病毒粒子的組裝和分泌；其前S區(qū)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)還可反式激活細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制等[5-7]。(2)HBV-LP存在超量表達(dá)：有研究以鴨乙型肝炎為模型證實(shí)亞病毒顆粒能夠反式激活病毒，使病毒復(fù)制重新激活，能顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制和基因表達(dá)[8]。這種增強(qiáng)作用提示HBV的血清感染性不僅依賴于感染性病毒Dane 顆粒的數(shù)量，還與富含HBV-LP的亞病毒顆粒的數(shù)目緊密相關(guān)。(3)單抗特異識(shí)別檢測(cè)HBV-LP：機(jī)體免疫壓力和藥物壓力等因素，使HBV基因組的前C區(qū)和核心啟動(dòng)子變異頻繁，HBeAg轉(zhuǎn)陰但病毒仍然復(fù)制，因此HBeAg陰性的乙型肝炎感染流行率呈不斷升高趨勢(shì)；而已設(shè)計(jì)好的商品化PCR引物有一定的漏檢率；然而本研究使用包被針對(duì)立體構(gòu)象型表位的單克隆抗體檢測(cè)HBV-LP，受基因變異的影響較少。(4)HBV-LP消失晚于HBV-DNA[9]：HBV-LP反式激活作用與cccDNA再?gòu)?fù)制密切相關(guān)。由于抗病毒藥物(如核苷類)只能抑制肝臟內(nèi)病毒cccDNA的復(fù)制，而不可抑制已形成的病毒表達(dá)蛋白，不能減少前基因組RNA及mRNA，即以病毒DNA為模板的轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的翻譯表達(dá)不受影響，病毒在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)分泌不含DNA的空粒。同時(shí)外周血中有亞病毒粒數(shù)目約為Dane粒的1萬倍，故HBV-LP消除需要一定的半衰期，減退比HBV-DNA晚。對(duì)該類患者，肝臟cccDNA的降低程度遠(yuǎn)低于血清中HBV-DNA降低水平，肝臟cccDNA仍然較多存在，臨床出現(xiàn)抗病毒治療后患者HBV-DNA 已陰轉(zhuǎn)、HBeAg發(fā)生血清轉(zhuǎn)換，而HBV-LP仍在一段時(shí)間內(nèi)存在。

本研究結(jié)果顯示，HBeAg陰性而HBeAb陽(yáng)性患者HBV-LP與HBV-DNA檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且不同HBV-M模式下，HBV-DNA和HBV-LP 的檢出率不同。分析2種常見“兩對(duì)半”模式，由于本研究肝癌或肝硬化患者較多，因此小三陽(yáng)居多。小三陽(yáng)患者HBV-DNA與HBV-LP檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，小三陽(yáng)HBV感染者檢測(cè)HBV-LP，能更準(zhǔn)確地判斷患者HBV復(fù)制情況。本研究結(jié)果顯示，HBV-LP在對(duì)照組血清中未能檢測(cè)到，提示只有HBV攜帶者或HBV患者才能檢測(cè)到HBV-LP。另外，本研究通過對(duì)所選標(biāo)本的肝功能分析發(fā)現(xiàn)，HBV-LP陽(yáng)性患者的ALT、AST水平高于HBV-LP陰性患者，由于ALT及AST是反映肝細(xì)胞損傷極為靈敏的指標(biāo)，HBV-LP與ALT、AST、AFP含量均呈正相關(guān)關(guān)系，提示HBV-LP表達(dá)與肝細(xì)胞損傷有關(guān)，可能與直接的肝細(xì)胞毒性及HBV的活動(dòng)性相關(guān)。

HBV-LP陰性或許可作為抗病毒治療終點(diǎn)的輔助指標(biāo)之一，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有較高的應(yīng)用價(jià)值。GRIPON等[10]研究發(fā)現(xiàn)，源于大蛋白的乙?；亩文苁垢渭?xì)胞表面的受體失活，切斷病毒感染其他肝細(xì)胞的途徑。只有當(dāng)血清HBV-DNA和HBV-LP均檢測(cè)不到時(shí)，說明病毒核酸復(fù)制、外膜蛋白的表達(dá)均處于停止?fàn)顟B(tài)，提示抗病毒治療達(dá)到較為理想的目標(biāo)，可較好地避免HBV-DNA病毒變異陰轉(zhuǎn)之后，造成漏檢，導(dǎo)致患者病情出現(xiàn)反復(fù)[11-12]。有研究表明，HBV感染肝細(xì)胞合成的大蛋白數(shù)量遠(yuǎn)超過病毒形態(tài)發(fā)生所需數(shù)量，在缺少病毒核衣殼的條件下，最終形成球狀或纖維狀的空的亞病毒顆粒(SPVS)，其在細(xì)胞內(nèi)積累可導(dǎo)致肝細(xì)胞液泡化和細(xì)胞凋亡[13]。提示HBV-LP含量的連續(xù)檢測(cè)有利于對(duì)慢性HBV預(yù)后的監(jiān)測(cè)，防止或延緩肝硬化或肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，由于HBV-LP是導(dǎo)致肝臟細(xì)胞損傷、病變及死亡的主要原因之一，且能反式激活HBV病毒，促進(jìn)其復(fù)制，因此HBV-LP是能夠很好地反映患者的病毒復(fù)制、肝細(xì)胞損傷、疾病進(jìn)程、療效與預(yù)后判斷的新的靈敏監(jiān)測(cè)指標(biāo)。HBV-LP采用ELISA法檢測(cè)比HBV-DNA采用PCR定量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和條件要求均低，其檢測(cè)簡(jiǎn)單、快速，可作為“兩對(duì)半”檢測(cè)的補(bǔ)充，特別適合各級(jí)醫(yī)院、各類人群作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。當(dāng)然，考慮到各項(xiàng)指標(biāo)并非完全一致， HBV-LP與HBV-DNA、乙型肝炎“兩對(duì)半”和肝功能聯(lián)合檢測(cè)，將會(huì)更全面地反映HBV感染患者血清的病毒復(fù)制及感染狀態(tài)，對(duì)患者的抗病毒治療，以及臨床療效、預(yù)后觀察具有指導(dǎo)性作用，促進(jìn)患者HBV清除和慢性肝性疾病康復(fù)。