張艷芳，謝豐華，李閃閃，鐘裕恒，黃 湘

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)期診斷中心，廣東中山 528403)

耳聾是指聽覺系統(tǒng)中各轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及神經(jīng)功能發(fā)生病變引起的聽力功能障礙，對患者的工作、學(xué)習(xí)和生活產(chǎn)生明顯影響[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國新生兒耳聾的發(fā)病率約為0.8%～1.0%，約80%的患兒除耳聾癥狀外不合并其他臨床癥狀，此類為非綜合征型耳聾[2]。近年來大量臨床研究證實(shí)，基因突變是引起非綜合征型耳聾的主要遺傳因素，GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12S rRNA基因、GJB3基因是非綜合征型耳聾的主要致聾基因[3-4]。現(xiàn)探討中山市耳聾基因的攜帶情況及其與聽力篩查的相關(guān)性，為新生兒聽力篩查的方案選擇和聽力障礙的防治提供科學(xué)依據(jù)，分析中山市非綜合征型耳聾新生兒常見耳聾基因突變狀況及耳聾基因突變致病性的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年11月至2017年10月該院分娩并做耳聾基因篩查的4 370例新生兒，男2 256例，女2 114例，年齡0～45 d。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕周：38～41周，足月分娩。(2)出生時體質(zhì)量≥2 500 g。(3)出生后3 min新生兒阿氏(Apgar)評分>8分。(4)未合并耳聾外其他臨床癥狀。本研究獲得該院倫理委員會批準(zhǔn)，且患兒家屬知情同意。

1.2儀器與試劑 基因擴(kuò)增采用東勝ETC811 PCR儀，濃度和純度檢測使用博奧晶芯NanoQ微型分光光度計，芯片雜交采用CapitalBio BioMixerTMⅡ雜交儀，應(yīng)用CapitalBio LuxScan-10K/B微陣列芯片掃描儀分析雜交結(jié)果。采用自動聽性腦干反應(yīng)(AABR)聽力篩查儀完成新生兒聽力學(xué)篩查。DNA提取試劑盒購自廈門致善生物全血提取試劑盒；遺傳性耳聾基因初篩試劑盒購自北京博奧生物(晶芯九項(xiàng)，微陣列芯片法)，篩查4個耳聾基因最常見的9個突變位點(diǎn)；基因初篩陽性標(biāo)本送至北京博奧生物有限公司進(jìn)行耳聾相關(guān)基因測序(毛細(xì)管電泳法)。

1.3方法

1.3.1聽力學(xué)篩查 由中山市博愛醫(yī)院兒?？苹蚨呛砜圃谛律鷥撼錾? d內(nèi)進(jìn)行。聽力篩查雙耳均通過記為“均通過”；左耳通過右耳未通過、左耳未通過右耳通過均記為“單側(cè)通過”； 雙耳均未通過記為“均未通過”；“單側(cè)通過”“均未通過”者合記為“未通過”。對初篩“未通過”者在出生30～42 d內(nèi)進(jìn)行“復(fù)篩”。聽力學(xué)篩查環(huán)境條件和標(biāo)準(zhǔn)均符合國家相關(guān)規(guī)定。

1.3.2耳聾基因的分子學(xué)篩查 本研究共檢測4個基因9個位點(diǎn)，包括GJB2基因位點(diǎn)(35delG、176 del16、235 delC、299 delAT)、SLC26A4基因位點(diǎn)(2168A>G、IVS7-2A>G)、線粒體12S rRNA基因位點(diǎn)(1494C>T、1555A>G)、GJB3基因位點(diǎn)(538C>T)，檢測過程遵守試劑盒相關(guān)操作要求及國家關(guān)于分子實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定。具體操作：(1)DNA提?。翰杉律鷥耗殠а?～3 mL EDTA抗凝，24 h內(nèi)按照使用說明書步驟提取DNA。提取DNA濃度和純度，4 ℃保存24 h內(nèi)用于下游耳聾基因的篩查。(2)耳聾基因篩查：取適量已提取的DNA稀釋至濃度為100～200 ng/μL ，純度為OD 260/280=1.7～2.0，剩余標(biāo)本―80 ℃保存。PCR擴(kuò)增、雜交、芯片的洗滌、干燥、讀片均依照晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測試劑盒和相關(guān)儀器使用要求進(jìn)行。

1.4耳聾相關(guān)基因突變確診 耳聾相關(guān)基因測序分析(毛細(xì)管電泳法)。對初篩陽性或聽篩未通過的新生兒根據(jù)突變基因和監(jiān)護(hù)人意愿選擇性進(jìn)行耳聾相關(guān)基因的毛細(xì)管電泳法測序分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)、百分率表示，使用χ2檢驗(yàn)和秩和轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1新生兒臍血標(biāo)本耳聾基因篩查結(jié)果 4 370例新生兒有159例檢測到耳聾基因突變，檢出率為3.64%(159/4 370)，其中GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA、GJB3基因突變檢出率分別為2.29%、1.08%、0.21%、0.07%。男性檢出率為4.03%(90/2 256)，女性檢出率3.26%(69/2 114)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 159例新生兒耳聾基因篩查突變類型及百分率結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

2.2非綜合征型耳聾患兒耳聾基因突變

2.2.1非綜合征型耳聾基因陽性患兒一般資料 159例非綜合征型耳聾患兒男性占56.60%(90/159)，女性43.30%(69/159)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；初篩陽性患兒選擇測序49例(30.82%，49/159)，未測序110例(69.18%，110/159)，測序和初篩結(jié)果符合率為98.00%(48/49)、不符率2.00%(1/49)；159例均接受AABR，其中“均通過”率85.53%(136/159)，“單側(cè)通過”率6.92%(11/159)，“均未通過”率7.55%(12/159)，合并“未通過”率14.46%(23/159)。4例復(fù)合雜合突變或純合突變，1例均質(zhì)突變“均未通過”。

2.2.2非綜合征型耳聾患兒耳聾基因突變篩查陽性結(jié)果 耳聾基因突變的GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA、GJB3基因突變百分率依次為62.89%、29.56%、5.66%、1.89%。GJB2基因和SLC26A4基因?yàn)橹饕蛔兓?，其中GJB2基因突變患兒62.89%(100/159)，主要突變位點(diǎn)為235delC，主要突變形式為雜合突變，復(fù)合雜合突變2例；SLC26A4基因突變患兒29.56%(47/159)，主要突變位點(diǎn)為IVS7-2A>G，主要突變形式為雜合突變，純合突變、2168A>G/IVS7-2A>G復(fù)合雜合突變各1例；線粒體12S rRNA基因突變5.66%(9/159)，主要突變形式為均質(zhì)突變，異質(zhì)突變型1例。GJB3 538C>T雜合突變1.88%(3/159)。耳聾基因突變百分率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

2.2.3耳聾基因篩查突變陽性患兒的聽力學(xué)篩查結(jié)果 159例耳聾基因初篩突變陽性患兒的聽力學(xué)篩查結(jié)果顯示，聽力學(xué)篩查“均通過”“單側(cè)通過”“均未通過”分別為85.53%(136/159)、6.92%(11/159)、7.55%(12/159)，合并未通過為14.47%(23/159)；GJB2基因突變患兒聽力學(xué)篩查通過率為84.00%(84/100)、未通過率為16.00%(16/100)；SLC26A4基因突變患兒通過率為87.23%(41/47)、未通過率為12.77%(6/47)；線粒體12S rRNA基因突變患兒通過率為88.89%(8/9)、未通過率為11.11%(1/9)。3例GJB3基因突變患兒均通過。共18例雜合突變、1例IVS7-2純合子突變、3例235delC/299delAT、35delG/235delC、2168A>G/IVS7-2A>G復(fù)合突變聽力學(xué)篩查雙耳均未通過。4個基因突變對聽力的影響進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.839，P=0.840)。見表2。

2.4耳聾相關(guān)基因測序分析(毛細(xì)管電泳法) 49例陽性篩查患兒的耳聾相關(guān)基因的毛細(xì)管電泳法測序結(jié)果和初篩結(jié)果符合率為98.00%(48/49)，不符率為2.00%(1/49)；不符1例是初篩為SLC26A4 2168A>G雜合突變而測序未檢出突變，其余測序結(jié)果均和初篩芯片檢測覆蓋基因位點(diǎn)的檢測結(jié)果相符合。但耳聾基因測序檢出初篩未覆蓋的位點(diǎn)14例，其中位點(diǎn)109G>A異常4例，79G>A、341A>G、299-300deIAT異常各2例，608A>G、608T>C、426A>T、176-191deI16異常各1例， 109G>A、341A>G、299-300deIAT位點(diǎn)異常共4例，為聽力學(xué)篩查“未通過”。共5例耳聾基因篩查突變陽性且“未通過”聽力學(xué)篩查的患兒選擇耳聾相關(guān)基因測序確診，測序證實(shí)2例GJB2 235delC為235delC復(fù)合109G>A突變，2例GJB2 235delC和1例SLC26A4 IVS7-2雜合突變與初篩結(jié)果一致。見表3。

表2 159例新生兒耳聾基因初篩突變的聽力學(xué)篩查結(jié)果

注：―表示無數(shù)據(jù)

注：1表示235delC/299delAT雙重雜合突變；2表示235delC雜合突變；3表示235delC純和突變

圖1 篩查陽性芯片掃描示意圖

注：―表示無數(shù)據(jù)

3 討 論

本研究對中山市4 370例新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查表明，耳聾基因突變檢出率為3.64%(159/4 370)，與湖北市(實(shí)時熒光定量PCR法)和佛山市[基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)]報道的一致[5-6]；低于石家莊(實(shí)時熒光定量PCR法)和2016年中山市(微陣列芯片法)對906例新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查的檢出突變率[7-8]；高于武漢市(實(shí)時熒光定量PCR法)檢出的3.00%突變率。本研究結(jié)果顯示，GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA、GJB3基因突變檢出率分別為2.29%、1.08%、0.21%、0.07%，基因突變百分率依次為62.89%、29.56%、5.66%、1.89%，與佛山市的結(jié)果一致，與中山市2016年的906例新生兒結(jié)果有差異。比較中山市與湖北、合肥(微陣列芯片法)、深圳(MALDI-TOF MS )、廣州(微陣列芯片法)、石家莊、中國西北地區(qū)(耳聾相關(guān)基因測序法)等地的篩查結(jié)果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[9-10]。提示各個地區(qū)、單個地區(qū)不同時期擴(kuò)大研究樣本數(shù)后檢出率、基因構(gòu)成百分率存在差異，各個地區(qū)建立合適的研究模型、定期更新分析該地區(qū)的耳聾基因譜有助于為當(dāng)?shù)嘏R床開展非綜合征型耳聾的相關(guān)診療活動提供指導(dǎo)和支持。

本研究對耳聾基因篩查陽性的159例患兒進(jìn)行聽力學(xué)篩查，結(jié)果顯示雙耳均通過率為85.53%、未通過率為14.47%，與湖南的研究結(jié)果一致；高于武漢市耳聾基因突變患兒的聽力學(xué)篩查未通過率(8．75%)。聽力學(xué)篩查通過率為未通過率的6倍，其中SLC26A4(PDS)、線粒體12S rRNA基因突變患兒的聽力學(xué)通過率為87.50%(49/56)，表明僅從聽力學(xué)篩查對耳聾基因突變患兒的早期防治不準(zhǔn)確，而耳聾基因篩查能及早發(fā)現(xiàn)突變患兒，及時采取指導(dǎo)和預(yù)防治療措施減少患兒聽力損失。對各個基因的既往研究報道，SLC26A4(PDS)基因突變主要與大前庭導(dǎo)水管綜合征有關(guān)，使大前庭導(dǎo)水管或內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大，患兒頭部碰撞和感冒等顱內(nèi)壓變化引起聽力下降[11]；線粒體12S rRNA基因?yàn)槟赶颠z傳，主要與氨基糖苷類藥物性耳聾有關(guān)，低劑量的氨基糖苷類藥物即可引起嚴(yán)重的聽力減退。對SLC26A4(PDS)、線粒體12S rRNA基因突變患兒做好指導(dǎo)和防護(hù)，減少外界因素所致的患兒耳聾加重，發(fā)藥物性卡片提醒患兒及母系家庭成員終生禁止服用氨基糖苷類藥物，可避免患兒成長中因未進(jìn)行耳聾基因篩查造成漏診而未采取防護(hù)措施導(dǎo)致的一針致聾及耳聾加重。GJB2基因?yàn)殡[性遺傳，與重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)，發(fā)病年齡主要在嬰、幼兒期，隨發(fā)病年齡的增大，聽力損失比例下降；GJB3為常染色體顯性和隱性遺傳，與后天高頻感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)。本研究GJB3基因突變患兒聽力學(xué)篩查通過率為100.00%(3/3)，對GJB3突變患兒定期檢查，注意高頻聽力損失可減少后天耳聾或耳聾加重[12]。本研究GJB2基因突變患兒的聽力學(xué)篩查通過率為84.00 %(84/100)，患兒早期使用助聽器和電子耳蝸植入治療，可減少患兒成長過程中因發(fā)現(xiàn)較晚導(dǎo)致的不可挽回的耳聾加重。

篩查陽性測序和初篩符合率為98.00%。1例初篩陽性而測序未發(fā)現(xiàn)突變患兒提示本研究耳聾基因初篩實(shí)驗(yàn)方法存在假陽性；其余48例測序結(jié)果均包括初篩陽性檢出位點(diǎn)，共14例測序檢測到陽性突變而初篩未覆蓋的耳聾基因位點(diǎn)，其中109G>A、341A>G、299-300deIAT共4例為聽力學(xué)篩查“未通過”，其他地區(qū)如北京、深圳、廣東、天津、石家莊、廣西、寧夏等地開展耳聾基因篩查研究覆蓋位點(diǎn)較多，包括299-300delAT檢測位點(diǎn)，但無109G>A、341A>G基因突變初篩位點(diǎn)報道。除本研究外，中國西北地區(qū)也報道耳聾基因測序發(fā)現(xiàn)109G>A、341A>G、299-300deIAT陽性病例[13]。結(jié)合本研究耳聾基因初篩位點(diǎn)的局限性和篩查陽性的測序結(jié)果，提示可將109G>A、341A>G、299-300deIAT納入中山市新生兒耳聾基因篩查位點(diǎn)，以提高耳聾基因初篩的敏感性。因本研究該類陽性例數(shù)較少，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大研究證實(shí)該位點(diǎn)的突變對聽力損失的影響。

綜上所述，中山市耳聾基因檢出率處于全國耳聾基因檢出率中等水平，對比各地耳聾基因突變檢出率和構(gòu)成百分率，表明進(jìn)行該地區(qū)耳聾基因篩查結(jié)果可指導(dǎo)臨床合理使用耳聾基因篩查，對各個基因突變患兒采取相應(yīng)的指導(dǎo)和防護(hù)措施，可有效避免耳聾及耳聾加重。本研究測序和篩查結(jié)果顯示初篩準(zhǔn)確率高，可早期篩查攜帶耳聾基因患兒，為臨床早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療非綜合征型耳聾提供參考依據(jù)和醫(yī)學(xué)咨詢，減少耳聾的發(fā)生及加重，提高患兒的社會適應(yīng)能力和生活質(zhì)量。