郭開發(fā),趙思峰,吳彩蘭,艾尼古麗·依明

(新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學農學院,新疆 石河子 832003)

農田防護林是由樹木組成的具有多種功能的人工廊帶網(wǎng)絡系統(tǒng),對改善農田小氣候,減輕和防御各種自然災害,保證農業(yè)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)作用明顯。在西北干旱地區(qū),改善林帶小氣候,是農田防護林的主要作用,其次在防風固沙、增加生物多樣性、凈化空氣、碳匯和保障作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)等方面起到重要作用[1-2]。新疆南疆主要造林樹種有新疆楊Populusalbacv.pyramidalis、箭桿楊P.nigracv.Afghanica、柳樹Salixmatsudana、榆樹Ulmuspumila、胡楊Populuseuphratica等,這些樹種具有生長快、耐干旱、耐寒冷、防護效益高等優(yōu)點。但因缺水干旱、單一種植、經(jīng)營管理粗放、防治措施不當?shù)?新疆農田防護林腐爛病危害嚴重,防護林的可持續(xù)效益和生態(tài)環(huán)境屏障功能受到嚴重制約。克熱曼 等[3]對克拉瑪依市林木病害進行了調查,結果表明楊樹Populusspp.、榆樹 、柳樹、白蠟Fraxinuschinensis、沙棗Elaeagnusangustifolia、衛(wèi)矛Euonymusalatus等林木均有腐爛病的發(fā)生,其中楊樹腐爛病發(fā)生程度最為嚴重。作者2012—2015年采集南疆農田防護林主要樹種腐爛病樣品 ,采用形態(tài)學特征結合分子生物學技術,對南疆農田防護林主要樹種腐爛病的病原菌進行了鑒定,以期為今后有效防治該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 感病樣本采集 從新疆楊、箭桿楊、胡楊、柳樹4種主要樹種上采集腐爛病樣本52份(表1)。所采集的枝條樣品均表面有黑色的分生孢子器,分生孢子器上產(chǎn)生卷須狀黃色或粉紅色分生孢子角。

1.2 病原菌分離與致病性測定

1.2.1 分離與純化 病原菌采用常規(guī)組織分離法分離[4]。先在 PDA 培養(yǎng)基上進行分離,待分離物長出后,在WA培養(yǎng)基上進行單孢純化,獲得的菌株保存在試管PDA 斜面上,置于4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 采用離體枝條接種法[5]進行致病性測定。選擇 1 a生健康林木新鮮枝條,截成約20 cm長小段,先用自來水沖洗后,再用 0.1% HgCl2浸泡 1 min,然后用無菌水沖洗、晾干,枝條兩端用保鮮膜將保濕脫脂棉包裹。用鐵釘釘帽 (直徑 7 mm)加熱后燙傷枝條樹皮,以菌絲塊 (直徑7 mm) 接種在燙傷部位,用保鮮膜將其包裹。每個分離物接種 5 段枝條,每段枝條接種 2 處,以無菌 PDA 餅作為空白對照。接種枝條放置于白瓷盤,在28 ℃光照培養(yǎng)箱中發(fā)育,接種 7 d 后觀察、記錄枝條發(fā)病情況,并對發(fā)病枝條進行再分離。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 將供試菌株接種在離體林木枝條上,待其產(chǎn)生分生孢子器后,用雙面刀片切片,制成玻片后在生物顯微鏡下觀察縱、橫切面形態(tài)特征,并測量分生孢子大小,記錄并拍照[6-7]。

1.3.2 分子生物學鑒定 依據(jù)形態(tài)學鑒定結果,挑選部分代表菌株在 PDA 平板上培養(yǎng) 5 d后,采用Lee等[8]的方法提取菌絲基因組DNA。借鑒Peever 等[9]的方法,用通用引物ITS1和ITS4擴增代表菌株的ITS和5.8S rDNA,用引物Beta-2a和Beta-2b擴增代表菌株的β-tubulin 基因。PCR反應體系:PCR TaqMix 12.5 μL、10 μmol/L ITS1/ Beta-2a 1 μL、10 μmol/L ITS4/ Beta-2b 1 μL、基因組 DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至終體積為 25 μL。ITS 序列 PCR 擴增反應程序為94 ℃ 預變性 4 min,然后94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸 10 min;β-tubulin基因 PCR 擴增反應程序:94 ℃預變性 4 min,然后 94 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共 30 個循環(huán),最后 72 ℃ 延伸 10 min。反應完成后,1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 反應產(chǎn)物。

將不同引物PCR 反應產(chǎn)物進一步純化后,送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行基因測序。測序后的序列經(jīng)校正后,在GenBank 中進行同源序列搜索( BLAST搜索),比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應序列的同源程度。用 MEGA 5 軟件進行比對并構建系統(tǒng)樹,應用自展(bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹,自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結果與分析

2.1 病原菌致病性 人工離體接種1～2 a生新鮮林木枝條后,各分離菌株均可導致林木枝條發(fā)病。接種 7 d 后接種部位出現(xiàn)褐色、水浸狀病斑。隨后病斑沿接種部位擴展呈圓形。離體枝條病斑部位表皮皺縮,病健交界明顯(圖1)。接種 20 d 后,病斑表皮皺縮,且產(chǎn)生大量黑色小點,室溫條件下溢出黃色分生孢子角,對發(fā)病組織進行再分離,均可獲得相應的接種菌株。對照枝條上未出現(xiàn)癥狀。

圖1 腐爛病菌致病性測定結果

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 從新疆南疆農田防護林腐爛病樣品中共分離獲得了52個菌株。其中新疆楊分離得到6株,箭桿楊17株,胡楊12株,柳樹17株。鑒定出3種病原菌,分別是金黃殼囊孢Cytosporachrysosperma(有性型:Valsasordida),Cytosphoranivea(有性型:Leucostomaniveum)和Cryptosphaeriapullmanensis,由于腐爛病病原菌在新疆主要以無性世代存在,得到的52個菌株均為無性型(表1)。

表1 新疆南疆農田防護林主要樹種腐爛病病原菌分離結果

2.2.2 分子生物學鑒定 用真菌通用引物ITS1/ITS4在供試菌株中均可以擴增到550 bp 大小的片段,將PCR擴增得到的ITS序列測序,在GenBank 中比對發(fā)現(xiàn)菌株的ITS序列分別和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。選擇代表性的11個菌株與11個從GenBank下載的序列(3個V.sordida序列、2個L.niveum序列、2個V.mali序列、2個Cryptosphaeriapullmanensis序列、1個Cryptosphaerialigniota序列和外群Alternariasp.序列)共22個序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中7個菌株和V.sordida聚為一枝,自展支持率達到93%;2個菌株和L.niveum聚在一枝,2個菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一個分支,自展支持率均達到93%以上(圖2)。

用真菌引物Beta-2a/Beta-2b在供試菌株中均可以擴增到500 bp 大小的片段,將PCR擴增得到的ITS序列測序,在GenBank 中比對發(fā)現(xiàn)菌株的β-tubulin序列分別和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。選擇代表性的11個菌株與11個從GenBank下載的序列(3個V.sordida序列、2個L.niveum序列、2個V.mali序列、2個Cryptosphaeriapullmanensis序列、1個Cryptosphhaeriamulticontinentalis序列和外群Alternariasp.序列)共22個序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中7個菌株和V.sordida聚為一枝,自展支持率達到96%;2個菌株和L.niveum聚在一枝,2個菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一個分支(圖3)。

圖2 基于ITS序列構建的腐爛病菌及該屬其它真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

對新疆南疆農田防護林主要樹種腐爛病樣品進行了病原菌分離,采用形態(tài)學和分子生物學技術對分離菌株進行種類鑒定和致病性測定,結果表明引起新疆南疆農田防護林主要樹種腐爛病的病原菌有金黃殼囊孢C.chrysosperma,C.nivea和Cryptosphaeriapullmanensis,其中C.chrysosperma是主要種。Cryptosphaeriapullmanensis在國內鮮有報道,在胡楊上屬首次發(fā)現(xiàn)。

國內外對防護林的研究主要集中在其所產(chǎn)生的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益[10]。防護林的生態(tài)效益研究主要集中在防護林的農田小氣候效應及其對土壤結構、養(yǎng)分的改良作用[11],而目前對防護林病害的報道較少,因此加強新疆農田防護林病害的研究并以此為依據(jù)開展病害防治是維護新疆農業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡的新任務。

殼囊孢屬Cytospora真菌是引起樹木腐爛病的重要病原,其有性型是黑腐皮殼屬Valsa。危害新疆農田防護林的腐爛病病原菌均為無性型,未發(fā)現(xiàn)有性型。新疆農田防護林主要樹種是楊柳科林木,而引起楊柳科林木腐爛病的病原物主要有Cytosporaatrocirrhata[12],Cytosporachrysosperma[13],C.germanica[14],C.kantschavelii[15],C.tritici[16]。在我國西北、華北及東北地區(qū),Valsasordida被認為是引起楊樹腐爛病的主要病原菌,主要危害楊樹、柳樹、桉樹、榆樹等樹種[17-18]。楊明秀[19]從各地楊樹、柳樹、核桃等多種寄主均可分離得到C.chrysosperma,且致病性與寄主有關,即在楊樹上分離的病原菌對楊樹的致病性強于非楊樹寄主,但與地理位置無明顯關系。

腐爛病已成為新疆林木主要病害之一。在新疆南疆地區(qū)果園腐爛病發(fā)生嚴重,受害嚴重果園發(fā)病率達 70 %～90 %,可導致整園衰亡,腐爛病已對新疆林果生產(chǎn)和發(fā)展造成嚴重威脅[20]。在阿勒泰地區(qū),腐爛病危害人工種植的北京楊、俄羅斯楊、新疆楊、速生楊等楊屬樹種,發(fā)病率可達 90%以上[21]。本研究明確了新疆南疆農田防護林腐爛病的病原菌種類,將為農田防護林腐爛病的防治提供一定指導。

圖3 基于Beta-Tubulin序列構建的腐爛病菌及該屬其它真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹