陳瑞晗 曹靜樺 方永煌 黃國杰 董艷芬 梁燕玲 呂竹芬

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

烏欖(Canarium Pimela Koening)是橄欖科常綠大喬木，其根葉具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、清熱解毒、消腫止痛等功效。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)烏欖葉水提物具有快速降壓作用和減慢心率、降低心臟耗氧量、維持心功能、舒張血管平滑肌等作用〔1～6〕，本文旨在通過不同方法建立心律失常(AC)模型，觀察烏葉對(duì)AC的藥效作用。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)昆明小鼠60只，雌雄各半，體重18～20 g，購自廣東省動(dòng)物中心。SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。儀器：PcLab生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京薇信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)。藥物：烏葉由本課題組制備，藥材其采集點(diǎn)為中山地區(qū)。稱取烏欖葉，加入蒸餾水加熱回流2 h，濾過，收集藥液，剩余藥渣重新加水，再次加熱回流，濾過，收集藥液，合并兩次藥液，在60℃的烘箱中烘干，打粉保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)用藥時(shí)用生理鹽水配液。維拉帕米注射液(5 mg/2 ml)，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31021343，上海禾豐制藥有限公司；鹽酸維拉帕米片(40 mg/片)，批號(hào)：140101，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；氯化鋇粉劑(BaCl299%)，批號(hào)：10326-27-9，深圳市科天化玻儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1對(duì)BaCl2誘發(fā)小鼠AC的影響 將小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。用藥組分為維拉帕米組(0.065 g/kg)、烏葉高劑量組(1.6 g生藥/kg)和低劑量組(0.16 g生藥/kg)，每天以0.2 ml/10 g劑量灌胃1次，空白對(duì)照組和模型組以等容量生理鹽水灌胃，灌胃前3 h內(nèi)禁食不禁水，連續(xù)28 d。于第27天灌胃后禁食16 h，第28天灌胃1 h后，用4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉。利用Pclab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)正常心電圖，模型組和各用藥組5 min后尾靜脈注射0.1%BaCl2(2 mg/10 g)誘發(fā)AC〔7〕，空白對(duì)照組注射等容量生理鹽水，觀察和記錄心電圖30 min。

1.2.2對(duì)大鼠心肌缺血再灌注性AC的影響〔8,9〕將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、烏葉組(1 g生藥/kg)、維拉帕米組(5 mg/kg)，每組10只。以2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，從口腔經(jīng)咽喉行氣管插管，連接呼吸機(jī)維持呼吸(呼吸機(jī)實(shí)驗(yàn)參數(shù)：潮氣量為50 ml/kg，呼吸頻率為60次/min，呼吸比為2∶1)。開胸、暴露心臟，于左心耳下方2 mm處沿冠狀動(dòng)脈用縫合針穿一根線，待心電圖穩(wěn)定后開始全程恒速股靜脈滴注藥物(1～2 d/min)，假手術(shù)組和模型組滴注生理鹽水，給藥8 min后，將小膠管與冠狀動(dòng)脈一起結(jié)扎，7 min后抽離小膠管，解開結(jié)扎線，連續(xù)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電30 min。

1.2.3觀察指標(biāo) 記錄30 min的期前收縮(PB)、室性心動(dòng)過速(VT)、心室顫動(dòng)(VF)的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間及心率變化，并進(jìn)行AC評(píng)分。AC評(píng)分=lg PB次數(shù)+2(lg VT次數(shù))+2(lg VF次數(shù))+lg VF持續(xù)時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)BaCl2誘發(fā)小鼠AC的影響 空白對(duì)照組無AC發(fā)生。模型組出現(xiàn)明顯的AC，各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，死亡率高(P<0.01)，提示建模方法有效。與模型組比較，烏葉高劑量組、低劑量組均能顯著減少VT發(fā)生率和VF次數(shù)，縮短VT、VF的持續(xù)時(shí)間和死亡率(P<0.05，P<0.01)，與低劑量組比較，高劑量組顯著降低VT發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間(P<0.05)，降低PB次數(shù)、AC評(píng)分和死亡率(P<0.05)，主要表現(xiàn)為室性早搏二聯(lián)律，提示烏葉具有較強(qiáng)的抗AC作用，且呈一定量效關(guān)系，其作用效果與維拉帕米相近或略強(qiáng)，見表1。

表1 烏葉對(duì)BaCl2誘發(fā)小鼠AC的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與烏葉低劑量組比較：3)P<0.05；表2同

2.2對(duì)大鼠心肌缺血再灌注性誘發(fā)AC的影響 與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)明顯的PB、VT、VF，心率減慢顯著，各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，提示結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈至心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)AC建模成功。與模型組相比，烏葉組可顯著減少VF次數(shù)、縮短VF持續(xù)時(shí)間、AC持續(xù)時(shí)間及減緩心率降低(P<0.05)。維拉帕米作用效果與其相似，明顯降低PB次數(shù)和AC評(píng)分(P<0.05，<0.01)。見表2。

表2 烏葉對(duì)大鼠心肌缺血再灌注性誘發(fā)AC的影響

3 討 論

BaCl2誘導(dǎo)的AC與多種離子流相關(guān)，靜脈注射BaCl2可增加心肌蒲氏纖維Na+內(nèi)流，提高最大舒張期去極化的速率；可使心肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而誘發(fā)遲后除極；Ba2+、K+通道的開放阻斷劑，競爭性地抑制K+流出，提高自律性，從而引發(fā)AC〔10〕。

缺血再灌注AC是心肌在缺血一定時(shí)間后再恢復(fù)血流灌注而引起再灌注區(qū)域的心肌細(xì)胞能量不足或缺乏，心肌細(xì)胞離子通道電流失衡〔11〕，從而出現(xiàn)再灌注性AC。研究發(fā)現(xiàn)鈣超載和生成氧自由基與再灌注性AC(RPA)密切相關(guān)，在缺血缺氧的情況下，細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)為糖酵解，產(chǎn)生大量乳酸，使細(xì)胞內(nèi)H+增加，提高Na-H交換，抑制Na-Ca2+交換，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚、超載，在再灌注時(shí)逐漸加重，同時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基。鈣超載和氧自由基可損害線粒體，減少ATP生成，同時(shí)引起心肌細(xì)胞除極，動(dòng)作電位波幅降低，誘發(fā)平臺(tái)期電位的振蕩，導(dǎo)致AC〔12～14〕。另外有研究表明短暫性心肌缺血也可能誘發(fā)VF，尤其是在應(yīng)激或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下〔15〕。所以本實(shí)驗(yàn)采用心肌缺血再灌注致AC法，即結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，引發(fā)急性心肌缺血，再解開結(jié)扎線，建立AC模型，用以進(jìn)一步觀察烏欖葉對(duì)AC的拮抗作用。

維拉帕米是Ca2+拮抗劑藥物，可結(jié)合在選擇性過濾器的細(xì)胞內(nèi)側(cè)孔的中心腔中，物理地阻斷電壓門控Ca2+通道〔16〕，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維拉帕米均能顯著性拮抗小鼠尾靜脈注射BaCl2和結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈方法誘導(dǎo)的AC。烏葉作用效果與維拉帕米相似或略強(qiáng)，能顯著減少PB次數(shù)，縮短VT、VF和AC的持續(xù)時(shí)間，降低AC評(píng)分和死亡率，具有明顯的抗AC作用，為烏欖葉的藥效作用提供了新思路。研究發(fā)現(xiàn)，烏欖已有的化學(xué)成分，揮發(fā)性成分以單萜類為主，有一定的抗氧化活性和清除自由基的能力〔17〕。董艷芬等〔2,18〕實(shí)驗(yàn)表明，烏葉能有效阻斷細(xì)胞膜受體操縱性鈣通道，抑制外鈣內(nèi)流從而舒張血管平滑肌，說明烏葉抗AC作用的機(jī)制可能是通過阻斷鈣通道，抑制心肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流，降低其自律性，減慢房室結(jié)傳導(dǎo)速度，從而延長不應(yīng)期，進(jìn)而拮抗AC。但其具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

目前，治療AC主要以藥物為主，化學(xué)藥物雖然具有作用迅速，療效確切等特點(diǎn)，但都具有一定的不良反應(yīng)，如β受體阻斷劑、鈣拮抗劑均可引起和加重房室傳導(dǎo)阻滯，限制其長期應(yīng)用。而近幾年相對(duì)于化學(xué)藥物、天然藥物抗AC的價(jià)值逐漸得到了認(rèn)可，中醫(yī)藥治療因能夠?qū)Σ∪诉M(jìn)行整體調(diào)整，具有多靶點(diǎn)、多層次的干預(yù)效果而具有一定優(yōu)勢〔19，20〕。烏欖葉已被證明具有較強(qiáng)的舒張血管、降壓和減慢心率作用〔1～6〕，因此，烏欖葉具有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景和價(jià)值，進(jìn)一步深入研究其抗AC的有效成分及作用機(jī)制具有重要意義。