闞伯紅 王 煜 王一婧 高 青 趙 嵐 蘭 福 范英昌

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所 天津市針灸學(xué)重點實驗室，天津 300381)

ExpressionofsynaptophysininSAMP8hippocampalCA1regionandtheinterventionofacupuncture

KANBo-Hong,WANGYu,WANGYi-Jing,etal.

FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,TianjinKeyLaboratoryofAcupunctureandMoxibustion，Tianjin300381,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of synaptophysin in Alzheimer′s disease(AD) model mice SAMP8 hippocampus and the effect of acupuncture on them.MethodsThirty SAMP8 mice were randomly divided into model (P8) and acupuncture groups, senescence-accelerated mouse resistance (SAMR) 1 as normal control (R1) group. The morphology changes of hippocampal CA1 pyramidal cells were observed by HE staining, and the expression of synaptophysin in hippocampal was evaluated by real-time PCR and immunohistochemistry(P<0.05).ResultsThe morphology and structure of pyramidal cells in SAMP8 hippocampus CA1 region were significantly damaged, and acupuncture had good effect on them. The expression of synaptophysin in SAMP8 hippocampus CA1 region was decreased significantly compared with that of SAMR1, and acupuncture increased the expression of synaptophysin.ConclusionsThe hippocampal synapses in SAMP8 mice are damaged and acupuncture has therapeutic effects on them by improving the expression of protein and gene of synaptophysin.

【Keywords】 Acupuncture; Alzheimer′s disease; SAMP8; Synaptophysin

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進行性記憶缺損、認知損害和定向力障礙等，嚴(yán)重威脅老年人的身心健康。伴隨我國人口老齡化加劇，AD給家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，成為制約社會發(fā)展的重要因素。AD屬突觸障礙性疾病范疇〔1〕。突觸素(SYP)是特異性存在于突觸前囊泡膜表面上的一種蛋白質(zhì)，其密度間接反映突觸的數(shù)量、分布和密度〔2〕。過去研究表明，三焦針法可明顯改善AD的臨床癥狀〔3〕，但其作用機制有待進一步研究，尤其是對突觸的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑 mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒，均購自天根生化科技有限公司。引物由華大科技合成，SYP上游引物(AGTGCCCTCAACATCGAAGTC)，下游引物(CGAGGAGGAGTAGTCACCAAC)；內(nèi)參為GAPDH，上游引物(AGGTCGGTGTGAACGGATTTG)，下游引物(TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA)。兔抗小鼠多克隆抗體SYP購自美國Abcam公司。即用型鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)過氧化物酶試劑盒(SC1022)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(AR1022)、防脫玻片和封閉用正常兔血清，均購自武漢博士德公司。多聚甲醛、甲醛、水合氯醛、二甲苯、無水乙醇、伊紅和蘇木素等均為國產(chǎn)分析純級。

1.2主要儀器 微量生物分光光度計(DeNovix，DS-Ⅱ，美國)，梯度PCR儀(ABI，ProFlex，美國)，實時定量PCR儀(Roch，LightCycler@ 96，瑞士)，萬分之一天平(梅特勒-托利多，AE200，德國)，自動脫水機(Leica，TP1020，德國)，自動包埋機(Leica，EG1150H，德國)，自動切片機(Leica，RM2555，德國)，攤片機(Leica，HI1210，德國)，光學(xué)顯微鏡(Leica，DM3000，德國)，LAS圖像分析系統(tǒng)(Leica，4.0，德國)，恒流泵、恒溫箱、冰箱和微波爐均為國產(chǎn)。

1.3實驗動物分組及處理 以8月齡快速老化小鼠(SAMP8)為模型對照組(P8組)，以同月齡抗快速老化小鼠(SAMR1)為正常對照(R1組)，治療組(針刺組)對SAMP8給予三焦針法進行干預(yù)〔4〕，其余各組行相同程度的捉抓210 s。

1.4取材、提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR 將小鼠麻醉后脫臼處死，取得海馬組織CA1區(qū)組織，放入無RNA酶的EP管中，加入裂解液，以研磨棒研磨，按照試劑說明書提取總RNA，測得RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄說明書合成第一鏈，每20 μl反應(yīng)體系加入RNA 1.25 μg，模板1 μl，引物的終濃度為0.5 μmol/L，退火溫度60℃，其他參照說明書。

1.5腦組織切片制作 小鼠腦組織灌注方法參照李靈芝等〔5〕報道，對進針深度略作改動，有落空感時停止進針，其他步驟不變。用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)(pH7.4)充分沖洗，修塊，取含海馬的腦組織，常規(guī)脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋，用萊卡全自動切片機連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。貼于預(yù)先防脫處理的載玻片上，于60℃烤片30 min，行HE和免疫組織化學(xué)染色。

1.6HE染色步驟 切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水至水化。蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，溫水沖洗，伊紅染色后常規(guī)脫水，透明，封片。

1.7SABC法免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2孵育10 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水洗3次，每次2 min；流水沖洗5 min；1/100枸櫞酸鈉溶液、高壓2 min抗原修復(fù)。冷卻后0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1～2次，每次2 min；用兔抗血清50 μl封閉，濕盒內(nèi)室溫封閉45 min；傾去封閉液(不洗)，滴加兔抗SYP(1∶1 000)50 μl，于濕盒內(nèi)4℃過夜(約12 h)；復(fù)溫30 min，0.02 mol/L PBS洗洗3次，每次2 min；滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 50 μl，濕盒內(nèi)孵育45 min；0.02 mol/L PBS洗3次，每次2 min；滴加試劑SABC50 μl，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min；0.02 mol/L PBS洗4次，每次5 min；DAB鏡下控制顯色；自來水沖洗10 min；其余步驟同HE染色。

1.8圖像分析 在海馬CA1區(qū)域內(nèi)，每只小鼠取3張切片于20倍物鏡下隨機選取5個視域，以LAS4.0軟件系統(tǒng)攝像并進行分析，測量SYP陽性反應(yīng)物的平均光密度值，每張切片的5個視野取其平均值，對每組切片的平均光密度值進行統(tǒng)計分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)觀察 R1組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，有大量的神經(jīng)纖維發(fā)出；P8組錐體細胞排列松散，形狀欠規(guī)則，結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)纖維不明顯；針刺組略有改善。見圖1。

圖1 各組海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果(×200)

2.2海馬CA1區(qū)SYP的表達變化及針刺干預(yù)作用 SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于海馬 CA1 區(qū)的神經(jīng)氈區(qū)，呈顆粒狀或點狀免疫標(biāo)記，神經(jīng)元胞體、膠質(zhì)細胞及血管不被標(biāo)記，海馬以多形層和輻射層染色較深。R1組海馬 CA1 區(qū)染色較深，P8組顏色變淡，針刺組較R1組顏色明顯加深。見圖2。

R1組SYP陽性反應(yīng)物的平均光密度值(2 719.00±962.22)明顯大于P8組(14.48±6.95)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；針刺組SYP陽性反應(yīng)物的平均光密度值(1 714.23±784.44)大于P8組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)，但仍小于R1組。

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)及免疫組化染色(×200)

SYP mRNA含量反映各組中該基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差同質(zhì)，兩兩間差異顯著(P=0.000)，與R1組(設(shè)為1)相比，P8組SYP mRNA表達量(0.32±0.04)明顯降低(P=0.000)，針刺對其有正向調(diào)節(jié)作用(0.41±0.039，P=0.035)，但其表達量仍低于R1組(P=0.000)。

3 討 論

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一個重要組成部分，在信息處理中起重要作用，是學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)，其中海馬CA1區(qū)錐體細胞的易損性在認知損傷的發(fā)生中起重要作用〔6〕。SAMP8中CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量明顯減少〔7〕，突觸超微結(jié)構(gòu)受損〔8〕。突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的連接點，傳遞腦中的化學(xué)信號或電信號，對于學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，認知功能障礙的早期表現(xiàn)主要包括突觸丟失和突觸功能異?！?〕。

SYP是一種與突觸功能和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的突觸囊泡蛋白，參與了突觸囊泡的導(dǎo)入及轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸囊泡再循環(huán)過程，是突觸發(fā)生和重塑的重要標(biāo)志，可通過了解SYP的定位和定量反映突觸的分布及功能狀況。在神經(jīng)遭受損傷后功能逐漸恢復(fù)的過程中，SYP的表達量在一定程度上可較好地反映突觸再生和重塑的能力。AD 病人認知功能下降程度與海馬及相關(guān)皮層SYP的改變有很好的相關(guān)性〔10〕?；蛐酒芯勘砻鬏p度認知障礙(MCI)和AD患者海馬CA1區(qū)突觸基因(21/28)明顯降低(其中包括SYP)，而輕度認知障礙和AD中轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異〔6〕。Callahan等〔11〕發(fā)現(xiàn)SYP蛋白的丟失量與神經(jīng)元的神經(jīng)原纖維纏結(jié)呈正相關(guān)。許丹等〔12〕發(fā)現(xiàn)SYP表達量隨增齡而減低，且AD患者CA3區(qū)的表達量低于同齡人。Masliah 等〔13〕報道SYP免疫反應(yīng)性在MCI或輕度AD 病人的皮層下降25%，在中度、重度病人的皮層進一步下降。柴繼俠等〔14〕利用Western印跡法檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)drebrin和SYP蛋白表達，發(fā)現(xiàn)SYP在AD后期起作用。

SAMP8是研究AD的較理想的動物模型，自發(fā)快速老化和生存期變短，具有AD典型的病理改變，與SAMR1相比，早在4月齡時就發(fā)生認知功能損傷，5月齡時皮層神經(jīng)元減少和TAU蛋白過度磷酸化，6月齡時海馬樹突棘開始減少和β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積明顯增加，8月齡時海馬CA1區(qū)錐體細胞的數(shù)量明顯降低〔15〕。本文選擇的SAMP8相當(dāng)于中、重度AD患者，采用免疫組織化學(xué)方法檢測了SYP在海馬區(qū)域的分布和含量，發(fā)現(xiàn)SYP主要位于海馬CA1區(qū)的神經(jīng)氈區(qū)，SAMP8海馬CA1區(qū)SYP的表達量明顯降低，同上述結(jié)果相似。

針刺作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮了重要作用，且具備很好的安全性。針刺可以促進SAMP8突觸超微結(jié)構(gòu)和受體的改變〔16〕。針刺加康復(fù)可以增加局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠海馬CA3區(qū)SYP的表達，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重塑〔17〕。針刺可提高SYP的表達和促進腦癱鼠的運動功能恢復(fù)〔18〕?！叭埂贬樂ㄊ琼n景獻教授基于“三焦氣化失司導(dǎo)致癡呆”的病機理論所設(shè)，注重調(diào)節(jié)三焦涵蓋的臟腑功能，充分體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀〔19〕。過去研究表明該針法可增加多種神經(jīng)生長因子的水平，改善腦內(nèi)微環(huán)境〔20〕。本研究發(fā)現(xiàn)該針法可增加SAMP8海馬CA1區(qū)SYP的基因和蛋白表達，從而改善錐體神經(jīng)的形態(tài)。

本研究為針刺治療AD提供了理論和實驗依據(jù)，同時為AD的治療提供了一種選擇。