袁 慶 柴麗娟 王少峽 郭 虹 趙 莼 徐楊楊 馬萌萌 王喬悅 胡利民

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

Theanti-inflammatoryeffectofXinnaoshutonginhypoxiaandreoxygenationmousebrainmicrovascularendothelialcells

YUANQing,CHAILi-Juan,WANGShao-Xia,etal.

TianjinKeyLaboratoryofChineseMedicinePharmacology,KeyLaboratoryofPharmacologyofTraditionalChineseMedicalFormulaeMinistryofEducation，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Xinnaoshutong and its monomer component on the inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β in cerebral ischemia and reperfusion mouse brain microvascular endothelial cells line bEnd.3.MethodsIschemia-reperfusion inflammation injury bEnd.3 cells model was established, the effect of different concentrations Xinnaoshutong (0.1,1.0,10.0,50.0 μg/ml) or the monomer component(10μmol/ml) on cells vitality of bEnd.3 was detected. Inflammation-related factor TNF-α, IL-6, IL-1βlevel were measured by ELISA.ResultsXinnaoshutong significantly inhibited bEnd.3 cell cytoplasmic synthesis of TNF-α, while the supernatants of IL-6 secretion was inhibited but there was no statistical difference. The cytoplasmic synthesis or supernatants of IL-1β expression in bEnd.3 cells was not obvious.ConclusionsXinnaoshutong plays a therapeutic role in inflammatory injury of cerebral ischemia by inhibiting the synthesis inflammatory cytokines of TNF-α.

【Keywords】 Xinnaoshutong; Cerebral ischemia and reperfusion; Inflammatory cytokines; TNF-α; IL-6

腦缺血后的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)是造成腦組織繼發(fā)性損傷的因素之一，在此炎癥反應(yīng)的過程中，有多種因素相互作用，共同引起了再灌注損傷，并且以其預(yù)后差，死亡率高而日益引起人們的關(guān)注〔1〕。 心腦舒通膠囊是由中藥蒺藜屬植物蒺藜干燥的地上全草提取物而制成的膠囊劑，以蒺藜總皂甙為其主要成分，具有活血化瘀、祛痰化濕、補(bǔ)益肝腎等功效〔2～4〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有改善微循環(huán)，選擇性增加腦缺血部位的供血及提高抗氧自由基等作用〔5〕。但其在腦缺血再灌注炎癥損傷中發(fā)揮作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在考察心腦舒通及其單體成分對(duì)缺氧復(fù)氧合并腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激損傷后bEnd.3(小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)炎癥相關(guān)因子TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β釋放的影響，初步探討心腦舒通抗腦缺血再灌注炎癥損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 bEnd.3細(xì)胞株(ATCC，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基(Corning，美國(guó))，F(xiàn)BS(BI，美國(guó))，心腦舒通(吉林敖東股份有限公司，中國(guó))，化合物5：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-〔β-D-吡喃木糖基-(1→3)〕-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)〕-β-D-吡喃半乳糖苷})、原薯蕷皂苷(由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院張鵬老師提供)，無糖KRP(250 ml含NaCl 2.25 g/KCl 0.105 g/NaH2PO4·2H2O 0.032 5 g/ Na2HPO4·12H2O 0.180 25 g/MgSO40.067 5 g/CaCl20.081 g)，高糖KRP(在無糖KRP基礎(chǔ)上加葡萄糖1.125 g)，CCK-8 (CCK-8，Dojindo，日本)，TNF-α(R&D，美國(guó))，TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒(北京四正柏)，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo，F(xiàn)orma3111型，美國(guó))，倒置相差顯微鏡(Nikon，TE200，日本)，多功能讀板機(jī)(TECAN公司，瑞士)，低溫高速離心機(jī)(Beckman，64R型，美國(guó))。

1.2bEnd.3細(xì)胞的培養(yǎng) bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+20%FBS+1%雙抗的培養(yǎng)液中，隔天換液，每5天用0.25%的胰酶消化傳代，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3不同造模條件對(duì)bEnd.3細(xì)胞TNF-α、IL-6的影響 將傳代的細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)生長(zhǎng)至融合，對(duì)照組換成高糖KRP，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。模型組換成無糖KRP，在缺氧小室(94%N2+5%CO2+1%O2)中培養(yǎng)4 h，復(fù)氧時(shí)對(duì)照組換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)，模型組換含不同濃度的TNF-α(10、20、40 ng/ml)的DMEM，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。IL-6檢測(cè)分別于復(fù)氧1 d、2 d、3 d收集上清，用鼠IL-6 ELISA試劑盒檢測(cè)。TNF-α檢測(cè)：分別于復(fù)氧1 d、2 d、3 d用220 μl細(xì)胞裂解液(10 ml TBS中含20 μl Triton X-100，20 μl甘油)冰上振搖處理10 min收集胞質(zhì)裂解液，用鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)量(參照ELISA試劑盒說明書)。

1.4心腦舒通對(duì)正常培養(yǎng)的bEnd.3細(xì)胞活力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的bEnd.3細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而后加入含有不同濃度心腦舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或單體(10.0 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，24 h用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.5心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞活力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的bEnd.3細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合后，進(jìn)行細(xì)胞缺氧再灌及炎癥損傷，考察心腦舒通及其單體成分對(duì)bEnd.3細(xì)胞活力的影響，細(xì)胞分組如下：對(duì)照組：將細(xì)胞培養(yǎng)液置換為高糖KRP溶液4 h，而后換成正常無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。模型組：將細(xì)胞培養(yǎng)液置換為無糖KRP溶液4 h，而后換成含TNF-α(40 ng/ml)無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。不同濃度加藥組：將細(xì)胞培養(yǎng)液置換為無糖KRP溶液4 h，而后換成含不同濃度心腦舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或單體成分(10.0 μg/ml)的含TNF-α(40 ng/ml)無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.6心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞胞質(zhì)TNF-α的影響 將傳代的細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)生長(zhǎng)至融合，實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理同上，復(fù)氧3 d后用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液冰上振搖處理10 min，收集胞質(zhì)裂解液，用鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α量。

1.7心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細(xì)胞IL-6、IL-1β的影響 將傳代的細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)生長(zhǎng)至融合，實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理同上，復(fù)氧3 d后收集細(xì)胞上清，用鼠IL-6、鼠IL-1β ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度TNF-α對(duì)bEnd.3細(xì)胞TNF-α合成、IL-6分泌的影響 不同濃度TNF-α均能誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞胞質(zhì)TNF-α、上清IL-6的合成，且具有劑量依賴性。隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，胞質(zhì)TNF-α和上清IL-6的分泌逐漸升高，故研究確定TNF-α的刺激濃度40 ng/ml，復(fù)氧時(shí)間定為3 d(表1)。

表1 不同造模條件對(duì)bEnd.3細(xì)胞TNF-α合成及IL-6分泌的影響

與前一TNF-α濃度組比較：1)P<0.05

2.2心腦舒通對(duì)正常bEnd.3細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比，心腦舒通各濃度組及單體成分對(duì)正常培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞活力沒有影響，說明所采用濃度無細(xì)胞毒作用，并且不同濃度心腦舒通能顯著促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞的增殖(P<0.05)，見表2。

2.3心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比，模型組能顯著抑制bEnd.3細(xì)胞的增殖(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通(0.1、1.0 μg/ml)及其單體成分對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞活力恢復(fù)作用具有顯著性差異(P<0.05)，心腦舒通10.0、50.0 μg/ml組能恢復(fù)細(xì)胞活力但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細(xì)胞TNF-α合成量的影響 與對(duì)照組相比，模型組能顯著刺激bEnd.3細(xì)胞胞漿炎性因子TNF-α合成量(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通(0.1、1.0、10.0 μg/ml)及其單體成分能有效抑制缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞胞質(zhì)炎性因子TNF-α合成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，心腦舒通50.0 μg/ml組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.5心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細(xì)胞IL-6釋放量的影響 與對(duì)照組相比，模型組能顯著刺激bEnd.3細(xì)胞上清炎性因子IL-6釋放量(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通及其單體成分對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細(xì)胞上清炎性因子IL-6釋放有降低作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單體成分化合物5抑制作用有顯著差異(P<0.05)，見表3。

表2 心腦舒通對(duì)正常及模型損傷bEnd.3細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較: 2)P<0.05,下表同

表3 心腦舒通對(duì)模型損傷bEnd.3細(xì)胞TNF-α合成量及IL-6釋放量的影響

2.6心腦舒通對(duì)缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細(xì)胞IL-1β的影響 不同濃度TNF-α合并缺氧復(fù)氧刺激bEnd.3細(xì)胞，其合成及分泌IL-1β均非常少不以此作為模型選擇依據(jù)。

3 討 論

腦缺血再灌注過程中局部炎癥因子、趨化因子及黏附分子的表達(dá)上調(diào)構(gòu)成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，隨后白細(xì)胞向缺血區(qū)聚集和浸潤(rùn)，穿越血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，從而引起了腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)〔6〕。TNF-α是最重要的炎癥因子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)〔7〕，能通過促進(jìn)凝血、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性及誘導(dǎo)黏附分子或其他炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6 等多種炎癥因子的表達(dá)，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)，加重腦缺血再灌注損傷〔8～10〕。本實(shí)驗(yàn)過程選擇缺氧復(fù)氧合并TNF-α模型模擬腦缺血再灌注損傷的早期炎癥反應(yīng)〔11，12〕，通過檢測(cè)局部炎癥因TNF-α、IL-6、IL-1β，初步評(píng)價(jià)心腦舒通的抗炎作用及腦保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不影響細(xì)胞活力的情況下，心腦舒通各濃度組及單體成分均能較好地抑制炎癥因子TNF-α的釋放。劉雪梅等〔13～15〕在其實(shí)驗(yàn)研究中表明腦缺血再灌注后大鼠的血清和腦內(nèi)TNF-α和IL-1β大量表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加，且組織結(jié)構(gòu)疏松，尼氏小體明顯減少，神經(jīng)元丟失嚴(yán)重，而心腦舒通膠囊能有效抑制炎性因子TNF-α和IL-1β表達(dá)，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，從而保護(hù)受損的腦組織。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)心腦舒通能降低小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α的表達(dá)量，與其在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明心腦舒通有效抑制炎性因子TNF-α的表達(dá)可能是其治療腦缺血再灌注炎癥損傷的途徑之一。IL-1β是血漿和組織液中的主要形式，同時(shí)也是腦組織中的主要形式，參與了早期的炎癥反應(yīng)，IL-1β能夠刺激黏附分子及誘導(dǎo)其他的炎性介質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而腦缺血再灌注可以誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生〔16〕。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)炎癥因子IL-1β的作用結(jié)果顯示，不同復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)及不同濃度TNF-α刺激后模型組與對(duì)照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其原因可能是由于IL-1β在bEnd.3細(xì)胞中的表達(dá)量較少所致。

IL-6是一種促炎癥細(xì)胞因子，有研究表明，局灶性腦缺血再灌注損傷后的大鼠腦組織和外周血中均能觀察到IL-6的高表達(dá)，說明IL-6參與了腦缺血再灌注損傷〔17〕。 IL-6是某些自身免疫性疾病中的關(guān)鍵炎癥因子，與許多疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸都密切相關(guān)〔18，19〕。有研究表明，IL-6的表達(dá)量與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，可以作為判斷炎癥損傷的靈敏指標(biāo)〔20，21〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組IL-6的表達(dá)量呈明顯上升趨勢(shì)，說明IL-6參與了此炎癥損傷反應(yīng)過程。心腦舒通各濃度組及單體原薯蕷皂苷對(duì)炎癥因子IL-6的表達(dá)有降低趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著性差異。但其單體成分化合物5對(duì)IL-6的抑制具有顯著性差異，說明心腦舒通對(duì)IL-6的表達(dá)有一定的抑制作用。 本研究表明心腦舒通能有效抑制缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細(xì)胞TNF-α、IL-6的表達(dá)，提示其對(duì)缺血再灌注損傷的早期炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用而發(fā)揮腦保護(hù)作用。