劉春保

(三亞市中醫(yī)院，海南 三亞 72000)

老年人體內(nèi)固有水分和細(xì)胞中的水分減少，可引發(fā)皮膚干燥、皺紋增加，易導(dǎo)致局部或全身性的皮膚瘙癢〔1〕。目前對(duì)老年性皮膚瘙癢的發(fā)病機(jī)制尚未明確，導(dǎo)致缺乏有效的治療方案。相關(guān)研究認(rèn)為，免疫系統(tǒng)異常特別是T淋巴細(xì)胞因子失衡參與了其發(fā)病過程〔2〕。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1分屬于細(xì)胞黏附分子中的整合素家族、免疫球蛋白超家族，可調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的分泌〔3〕。老年性皮膚瘙癢在中醫(yī)理論中屬“癢風(fēng)”、“風(fēng)瘙癢”范疇，由風(fēng)濕、燥熱、血虛等因素引發(fā)〔4〕；西醫(yī)常用抗組胺或激素類藥物治療，但患者耐受性差且停藥后易復(fù)發(fā)〔5〕。本研究探討老年性皮膚瘙癢癥患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞因子變化及相關(guān)機(jī)制，分析安膚止癢濕敷方對(duì)T淋巴細(xì)胞因子平衡的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年1月至2017年6月三亞市中醫(yī)院收治老年性皮膚瘙癢患者96例為研究組。均符合以下條件：①年齡≥60歲，符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》老年性皮膚瘙癢癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②近1個(gè)月未接受皮質(zhì)類激素、免疫抑制劑治療；③認(rèn)知功能正常；④排除合并惡性腫瘤、肝腎功能障礙、嚴(yán)重感染、治療藥物過敏者。根據(jù)患者住院號(hào)的奇偶數(shù)分為治療A組和治療B組；治療A組49例，其中男29例，女20例；年齡60～76歲，平均(68.53±7.15)歲；病程4個(gè)月至7年，平均(2.95±1.78)年。治療B組47例，其中男29例，女18例；年齡60～78歲，平均(69.16±8.59)歲；病程5個(gè)月至7年，平均(3.05±1.92)年。另收集同期在我院查體健康老年人50名為對(duì)照組，其中男31名，女19名；年齡60～77歲，平均(69.02±6.38)歲。各組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；人淋巴細(xì)胞分離液，植物血凝素(PHA)購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；小鼠抗人LFA-1、ICAM-1單克隆抗體購(gòu)于北京盛世中方生物科技有限公司。

1.3治療方案和癥狀評(píng)分 治療A組口服氯雷他定(深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020092)，10 mg/次，1次/d；治療B組在A組基礎(chǔ)上加用安膚止癢濕敷方，組方：胡麻仁、火麻仁、桃仁、甘草、沙苑蒺藜、艾葉、生姜各30 g，粉碎后每次取10 g外用，2次/d。兩組均連續(xù)治療1個(gè)月。采用改良的瘙癢癥狀評(píng)分表評(píng)估癥狀，總分0～9分，其中瘙癢程度(0～4分)、部位(0～2分)、頻率(0～3)得分越高反映癥狀越嚴(yán)重。

1.4外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 抽取研究組與對(duì)照組外周靜脈血5 ml，放于肝素預(yù)處理的離心管中，加5 ml淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心30 min，取外周血單個(gè)核細(xì)胞層，D-Hank洗滌3次，2 000 r/min離心5 min，用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。

1.5細(xì)胞因子誘導(dǎo)與檢測(cè) DMEM配置濃度為500 μg/ml的PHA，向96孔板中每孔分別加入外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液和PHA溶液各300 μl，細(xì)胞終濃度為1×106/ml，PHA溶液終濃度為250 μg/ml，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中靜置48 h，收集上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞因子〔白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、干擾素(IFN)-γ〕水平，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6RT-PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中LFA-1、ICAM-1 mRNA表達(dá) Trizol法提取研究組與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。引物由上海羽朵生物科技有限公司合成，反應(yīng)體系30 μl，反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描得到目標(biāo)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算LFA-1、ICAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7Western印跡法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中LFA-1、ICAM-1蛋白表達(dá) RIPA試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總蛋白50 g，聚氰基丙烯酪正丁酯(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，分別滴加小鼠抗人LFA-1、ICAM-1一抗(1∶500稀釋)，鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，孵育4 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.1治療前研究組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞因子比較 治療前研究組外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-2、IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，IL-4、IL-10水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 治療前兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞因子水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2治療前研究組與對(duì)照組LFA-1、ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)情況 研究組LFA-1、ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.51±0.95、2.18±0.72，對(duì)照組分別為1.15±0.43、1.02±0.30；研究組LFA-1、ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別5.82±1.90、5.39±1.62，對(duì)照組分別為3.18±0.73、2.85±0.69。研究組LFA-1、ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3治療前研究組皮膚瘙癢癥狀評(píng)分與T淋巴細(xì)胞因子的相關(guān)性 研究組治療前皮膚瘙癢癥狀評(píng)分(5.37±2.85)分，Pearson分析顯示，IL-2、IFN-γ與癥狀評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.423、0.526，均P<0.05)；IL-4與癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.332，P<0.05)；IL-10與癥狀評(píng)分無(wú)相關(guān)性(r=-0.062，P>0.05)。

2.4不同治療組T淋巴細(xì)胞因子比較 治療后1個(gè)月，兩組IL-2、IFN-γ水平明顯低于治療前，IL-4、IL-10水平明顯高于治療前(P<0.05)；且治療B組改善程度明顯優(yōu)于治療A組(P<0.05)，見表2。

圖1 兩組LFA-1、ICAM-1蛋白電泳條帶

組別n時(shí)間IL-2IFN-γIL-4IL-10治療A組49治療前24.98±4.8219.11±4.437.85±3.558.72±3.91治療后1個(gè)月21.42±4.211)15.63±3.681)10.17±3.241)10.26±2.881)治療B組47治療前25.32±5.7619.03±4.767.89±3.768.85±4.43治療后1個(gè)月13.78±4.461)2)9.12±3.151)2)15.29±3.321)2)12.33±3.211)2)

與治療前比較：1)P<0.05；與治療A組比較：2)P<0.05

3 討 論

老年性皮膚瘙癢癥的發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前認(rèn)為體內(nèi)免疫系統(tǒng)異常，特別是T淋巴細(xì)胞因子失衡可能參與其發(fā)病過程。根據(jù)活化后分泌的細(xì)胞因子和生理功能可將T淋巴細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)亞群，其中Th1包括IL-2、IFN-γ等，Th2包括IL-4、IL-10等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2平滑失調(diào)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)〔6〕。細(xì)胞黏附分子是體內(nèi)具有重要生理活性的跨膜糖蛋白，其中LFA-1表達(dá)于白細(xì)胞表面，ICAM-1分布于外周血白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種組織細(xì)胞表面，二者表達(dá)水平可調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的分泌〔7〕。本研究結(jié)果提示老年性皮膚瘙癢患者存在T淋巴細(xì)胞因子失衡，表現(xiàn)為Th1功能亢進(jìn)、Th2功能下降，且與疾病發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)生機(jī)制提示LFA-1、ICAM-1表達(dá)上調(diào)可能介導(dǎo)了T淋巴細(xì)胞因子失衡，參與老年性皮膚瘙癢的發(fā)生、發(fā)展。

老年性皮膚瘙癢的臨床治療以口服抗組胺類藥和激素類外用軟膏為主，不良反應(yīng)明顯且耐受性差。中醫(yī)理論中將其歸為“癢風(fēng)”范疇，中藥外用方劑可有效止癢，輔助治療效果明顯。安膚止癢濕敷方具有收斂、消炎、鎮(zhèn)痛、止癢的功效，還能夠提升對(duì)組胺的致癢閾，可用于老年性皮膚瘙癢的輔助治療。本研究結(jié)果提示安膚止癢濕敷方有助于糾正患者T淋巴細(xì)胞因子失衡，達(dá)到治療目的。