閆如意，張倍寧，李考，鄭冬，宋淑軍，吳繼華，司少艷，周金蓮，崔彥，張建中

隨著載人航天技術(shù)的迅猛發(fā)展和空間探索活動的持續(xù)拓展，航天員在太空環(huán)境中的駐留時間不斷延長，航天微重力環(huán)境對人體生理健康的影響已引起廣泛關注[1-3]。航天飛行會導致航天員各系統(tǒng)一系列生理病理變化，內(nèi)分泌系統(tǒng)首當其沖。甲狀腺是人體重要的內(nèi)分泌器官，一旦發(fā)生病變會引起機體多系統(tǒng)代謝障礙[4-6]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類大小為21～25nt的高度保守的小分子非編碼RNA，位于內(nèi)含子或非編碼區(qū)的外顯子及基因間區(qū)，作為基因表達的重要調(diào)控分子，幾乎參與了機體所有的生理和病理過程[7-8]。本研究釆用旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system，RCCS)模擬微重力環(huán)境，觀察大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(Fisher rat thyroid cells line，F(xiàn)RTL-5)miRNA表達譜的變化并進行生物學功能分析，以期為航天員醫(yī)監(jiān)醫(yī)保工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 FRTL-5細胞株培養(yǎng)及實驗分組 FRTL-5購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，在含5%胎牛血清、6種激素替代物[5mU/ml促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/ml生長抑素、0.4ng/ml氫化可的松和10ng/ml甘氨酸-組胺酰-賴氨酸醋酸鹽]和雙抗(100μg/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)的F-12培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取生長狀態(tài)良好的第4～10代對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞隨機分為兩組：模擬微重力(simulated microgravity group，SMG)組和正常重力組(normal gravity group，NG)組，每組3個樣本。SMG組細胞與微載體共同置入高截面縱橫比容器(high aspect ratio vessel，HARV)，而后在RCCS中培養(yǎng)；NG組置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)。

1.2 建立RCCS微載體培養(yǎng)體系 將預先準備好的Cytodex-3微載體放入HARV中，加入配好的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的第4～10代對數(shù)生長期FRTL-5細胞以2×106/ml的密度接種于HARV，加滿培養(yǎng)基，用注射器排盡氣泡后放入RCCS。RCCS初始轉(zhuǎn)速為8r/min，轉(zhuǎn)動5min后停轉(zhuǎn)5min，反復3次后調(diào)整轉(zhuǎn)速至12r/min，定時觀察并調(diào)整轉(zhuǎn)速，以使微載體懸浮在培養(yǎng)液中。

1.3 樣本采集 培養(yǎng)24h后將HARV中的混合液吸出至一次性塑料離心管中，靜置15min后棄去上清，PBS洗滌3次，棄PBS，每個樣本加2.5g/L胰蛋白酶2ml，吹打混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，8min后加入2ml培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，輕輕吹打使細胞從微載體上脫落，通過細胞篩將細胞與微載體分離，細胞離心收集到1.5ml離心管內(nèi)。NG組按常規(guī)洗滌、胰酶消化、細胞離心處理。

1.4 總RNA提取和質(zhì)量檢測 各樣本中加入Trizol裂解，按照RNA分離試劑盒(Ambion抽提試劑盒)的操作步驟提取總RNA，利用NanoDrop定量并經(jīng)Agilent 2100檢測RNA完整性。

1.5 miRNA芯片及數(shù)據(jù)處理 RNA經(jīng)質(zhì)檢合格后，按照芯片標準流程分別進行樣品標記、芯片雜交、洗滌及掃描。利用Feature Extraction軟件(version 10.7.1.1，Agilent Technologies)從掃描圖片上提取數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)導入Genespring軟件(version 13.1，Agilent Technologies)，進行標準化及后續(xù)數(shù)據(jù)分析。利用t檢驗及倍數(shù)變化關系值進行差異miRNA的篩選，篩選標準為上下調(diào)倍數(shù)變化值≥2且P＜0.05。

1.6 反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(reverse transcriptionquantitative real-time PCR，RT-qPCR)驗證芯片結(jié)果 根據(jù)芯片檢測結(jié)果，選取原始信號值強、差異顯著的3個miRNA進行檢測，驗證芯片數(shù)據(jù)的可信度。設計特異性引物，以5S為內(nèi)參照，取各組樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增：95℃5min、95℃ 10s、60℃ 30s，40個循環(huán)后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性。將miRNA表達水平進行標準化處理，采用2–ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.7 功能分析

1.7.1 靶基因預測 使用Genespring13.1軟件，分別用microRNAorg和TargetScan數(shù)據(jù)庫共同對差異miRNA進行靶基因預測，取二者交集作為miRNA潛在調(diào)節(jié)靶基因。

1.7.2 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析統(tǒng)計每個GO條目中所包括的靶基因個數(shù)，計算每個GO條目中靶基因富集的顯著性。P值越小，靶基因在該GO條目中出現(xiàn)的富集程度越高，P＜0.05表示顯著富集。

1.7.3 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因進行通路分析，計算每個KEGG通路條目中靶基因富集的顯著性。P值越小，靶基因在該通路條目中富集程度越高，P＜0.05表示顯著富集。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以表示，多樣本比較，在滿足方差齊性的條件下，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA芯片檢測結(jié)果 比較SMG組與NG組FRTL-5芯片數(shù)據(jù)(倍數(shù)變化值≥2且P＜0.05)，篩查發(fā)現(xiàn)81個差異表達的miRNA。相較于NG組細胞，SMG組53個miRNA明顯上調(diào)，28個miRNA明顯下調(diào)。選取差異顯著且原始信號值較強的miRNA進行非監(jiān)督層次的聚類分析，將結(jié)果制成miRNA差異表達熱圖(圖1)。

圖1 微重力環(huán)境下大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞差異表達的miRNA聚類分析Fig. 1 Hierarchical cluster analysis of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment

2.2 RT-qPCR檢測結(jié)果 根據(jù)芯片檢測結(jié)果，選取rno-let-7b-3p、rno-miR-346、rno-miR-494-3p進行檢測，驗證芯片數(shù)據(jù)的可信度。設計引物序列如下：rno-let-7b-3p：CTATACAACCTACTGCCTTCCC；rno-miR-346：TGTCTGCCTGAGTGCCTGCCTCT；rno-miR-494-3p：TGAAACATACACGGGAAACCTCT；內(nèi)參5S：GGAGACCGCCTGGGAATA。對RT-qPCR檢測結(jié)果用2–ΔΔCt法相對定量分析顯示，以NG組為對照，SMG組rno-let-7b-3p、rno-miR-346的2–ΔΔCt值分別為0.11和0.03，均明顯下調(diào)(P＜0.05)，而rno-miR-494-3p的2–ΔΔCt值為1.98，表達明顯上調(diào)(P＜0.05)，表明RT-qPCR結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果一致。

2.3 靶基因預測及GO分析結(jié)果 對差異顯著且原始信號值較強的miRNA進行分析和靶基因預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個miRNA潛在調(diào)控眾多的靶基因。根據(jù)顯著富集結(jié)果(P＜0.05)，按P值的-log10排序，整理出顯著富集且與FRTL-5生長及功能相關的前20條基因本體功能條目(圖2)，-log10(P)值越大，該條目越顯著。結(jié)果顯示，預測靶基因與細胞老化、凋亡、對低氧的反應、轉(zhuǎn)錄、細胞黏附及炎癥反應等生物學過程相關。

2.4 靶基因KEGG信號通路分析結(jié)果 根據(jù)顯著富集結(jié)果(P＜0.05)，按P值的-log10排序，整理出顯著富集且與FRTL-5生長及功能相關的前20條信號通路條目(圖3)。結(jié)果顯示，預測靶基因與低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信號通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG)信號通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(fork head box transcription factor O，F(xiàn)oxO)信號通路、鈣信號通路、Ras相關蛋白1(ras-related protein 1，Rap1)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinaseprotein kinase B，PI3K-Akt)信號通路、鞘脂信號通路、溶酶體、甲狀腺激素信號通路相關。

圖2 微重力環(huán)境下大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞差異表達的miRNAs功能分布(GO分析)Fig. 2 Function distribution of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment by GO analysis

圖3 微重力環(huán)境下大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞差異表達的miRNAs功能分布(KEGG分析)Fig. 3 Function distribution of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment by KEGG analysis

3 討 論

航天研究及實踐證實，失重環(huán)境對甲狀腺有明顯影響。由于失重造成的體液頭頸向分布，甲狀腺處于持續(xù)充血狀態(tài)，加之甲狀腺組織細胞本身對重力變化的應激反應，會導致甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能異常，并容易引發(fā)甲狀腺疾病。甲狀腺的生理作用及病理變化影響非常廣泛，并涉及垂體軸的系統(tǒng)調(diào)節(jié)，機制十分復雜[4,9]。一旦航天員在航天飛行過程中出現(xiàn)甲狀腺功能異常以及由此引發(fā)的各種特殊情況，病情演變充滿變數(shù)，而救治條件極度受限，防控不當可影響航天員的健康安全和任務執(zhí)行能力。面對迅速發(fā)展的中長期航天飛行任務，航天員甲狀腺功能狀態(tài)的進一步研究和病理影響的有效防控已成為目前我國航天醫(yī)學亟待解決的重要問題之一[9]。

研究證實，失重或模擬失重對甲狀腺有重要影響[9]。Infanger等[10]在模擬微重力條件下培養(yǎng)HTU-5細胞12h后，觀察到細胞形成多細胞球狀體，細胞外基質(zhì)蛋白和β1-整聯(lián)蛋白增加，細胞角蛋白絲從中心延伸，較對照組細胞增稠、聚結(jié)和縮短。Kossmehl等[11]發(fā)現(xiàn)在模擬微重力條件下培養(yǎng)HTU-5細胞24h后細胞凋亡加劇，caspase-3激活，F(xiàn)as和Bax表達增加。Kopp等[12]通過對模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)7d及14d的甲狀腺細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)等促血管生成因子對失重條件敏感。有學者在微重力環(huán)境下對甲狀腺細胞及甲狀腺乳頭狀癌細胞的相關基因?qū)W改變和分子調(diào)控途徑進行研究并取得了重要進展[13-15]。

miRNA的發(fā)現(xiàn)是分子生物學的重要突破，作為高度保守的內(nèi)源性調(diào)控RNA，miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA，已經(jīng)成為各種生物學事件的關鍵調(diào)節(jié)劑，幾乎參與了機體所有的生理和病理過程，包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等[7-8]。研究微重力條件下甲狀腺miRNA的表達差異，可為航天失重環(huán)境中內(nèi)分泌系統(tǒng)的相關變化及疾病防控提供新的思路。

本研究采用miRNA芯片技術(shù)比較FRTL-5細胞在模擬微重力環(huán)境和正常重力條件下培養(yǎng)24h后miRNA的表達譜差異，共發(fā)現(xiàn)81個差異表達的miRNA，相較于NG組細胞，SMG組53個miRNA明顯上調(diào)，28個miRNA明顯下調(diào)；GO分析顯示這些差異miRNA主要參與了細胞老化、凋亡、對低氧的反應、轉(zhuǎn)錄、細胞黏附及炎癥反應等生物學過程。根據(jù)文獻報道，參與失重環(huán)境下控制細胞生命活動的信號通路有NF-κB信號通路、Notch信號通路、MAPK信號通路、熱休克信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、鈣離子信號轉(zhuǎn)導通路、VEGFR-2/VEGF-A信號通路、凋亡相關信號轉(zhuǎn)導通路和Rho信號轉(zhuǎn)導通路等[16-17]。本研究通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的miRNA參與的主要通路有NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路、鈣離子信號轉(zhuǎn)導通路、凋亡相關信號通路等，這從另外一個方面說明miRNA在失重環(huán)境下參與控制細胞生命活動的信號通路中扮演著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1信號通路居相關通路之首。根據(jù)文獻報道，HIF-1不但可以被低氧誘導，還可以被其他因素如高溫、低溫、輻射、炎癥反應等誘導，進而影響細胞存活、生長、分化及凋亡[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，尾懸吊模擬失重大鼠卵巢組織中HIF-1α蛋白及mRNA的表達發(fā)生了明顯變化，提示卵巢HIF-1α表達變化與失重應激反應和失重耐受有密切關系[19]。本研究芯片數(shù)據(jù)分析顯示，rno-let-7b-3p、rnomiR-346、rno-miR-494-3p均參與了HIF-1通路的相關活動，但具體作用及機制還有待進一步探討。

本研究的芯片分析及RT-qPCR均證實SMG組的rno-let-7b-3p表達較NG組顯著下調(diào)。Let-7是許多生物體中基因表達的關鍵調(diào)節(jié)劑，Let-7家族(let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g和let-7i)具有高度的序列和功能保守性，也是正常甲狀腺中表達最多的miRNA之一，在甲狀腺發(fā)育、功能及疾病發(fā)生過程中起重要作用。let-7可在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控凋亡相關因子Fas的表達，而Fas表達增加會抑制let-7的生物合成，即let-7和Fas之間是一種雙向調(diào)控關系[20-21]。另有研究證實，微重力培養(yǎng)甲狀腺細胞24h后可觀察到細胞凋亡及Fas的表達量增加[9]。本研究結(jié)果與文獻報道基本吻合，但對于let-7b-3p在凋亡相關通路中的精確調(diào)控仍需進一步深入研究。

微重力不僅影響細胞的增殖、分化，而且對其功能也會有不同程度的影響[16-17]。本研究通過KEGG分析，發(fā)現(xiàn)部分靶基因如白細胞分化抗原38(cluster of differentiation 38，CD38)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及白細胞分化抗原164(cluster of differentiation 164，CD164)等參與了鈣信號、過氧化物酶體和溶酶體等通路調(diào)節(jié)，這些通路已經(jīng)被證實與甲狀腺激素調(diào)節(jié)密切相關[22]；而對let-7b-3p、miR-346、miR-494-3p相關通路的分析表明，這3個miRNA無一例外地參與了以上通路的調(diào)節(jié)。分析認為，在微重力特殊環(huán)境中，這些差異miRNA有可能參與了對甲狀腺激素的調(diào)控，但其具體機制及相互關系尚需進一步研究。