曾婷婷，譚立明，田永建，余建林，吳洋，蔣永清

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，以小關(guān)節(jié)滑膜炎癥起病，病因尚未明確[1]。RA病程進(jìn)展到后期可導(dǎo)致局部或全身性骨質(zhì)破壞?；颊叱霈F(xiàn)關(guān)節(jié)功能損傷或骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥[2]。14-3-3η蛋白已被報(bào)道在RA患者血清中水平升高，且與RA骨質(zhì)破壞相關(guān)[3-4]，但其具體機(jī)制尚未闡明。本研究通過(guò)測(cè)定血清14-3-3η、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrulline polypeptide antibody，anti-CCP)及骨代謝相關(guān)指標(biāo)水平，評(píng)估14-3-3η對(duì)RA的臨床診斷價(jià)值，并分析其與RA患者骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2016年9月－2017年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的113例RA、40例骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和37例強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者以及該院同期健康體檢者77例。RA患者為RA組，診斷符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)RA診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。OA及AS患者為非RA(non-RA)組，患者診斷均符合相關(guān)指南[6-7]，并伴有明顯小關(guān)節(jié)痛。77例健康體檢患者為健康對(duì)照組。受試者血清標(biāo)本由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院生物樣本庫(kù)提供。所有標(biāo)本均在患者知情條件下獲得，并經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 符合條件者予以納入：①自愿參與研究，簽署知情同意書(shū)；②臨床診斷明確，臨床資料翔實(shí)；③OA及AS患者有明顯的小關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)；④資料經(jīng)重新評(píng)估，不合并其他自身免疫性疾病、骨質(zhì)疏松和(或)骨腫瘤等系統(tǒng)性骨病及其他各系統(tǒng)嚴(yán)重合并癥；⑤采血前2個(gè)月內(nèi)未發(fā)生骨折及服用各種影響骨代謝指標(biāo)檢測(cè)的藥物；⑥健康體檢者各項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的肝、腎、心或肺等系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌或免疫系統(tǒng)紊亂；②妊娠或哺乳期婦女及生長(zhǎng)發(fā)育期兒童。

1.3 試劑及方法 患者資料由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病例系統(tǒng)收集，包括患者性別、年齡、病程、晨僵時(shí)間、壓痛和(或)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)量、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)及紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)檢查結(jié)果等。采用ELISA檢測(cè)所有研究對(duì)象血清14-3-3η蛋白及anti-CCP水平，試劑分別購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司(武漢，中國(guó))和科新生物科技股份有限公司(上海，中國(guó))。血清RF水平通過(guò)速率散射比濁法測(cè)定，采用的IMMAGE 800全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)及配套試劑購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。RA患者血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、25羥維生素D[25-hydroxy vitamin D，25-(OH)D]、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、Ⅰ型膠原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of type I collagen，PINP)和β-膠原降解產(chǎn)物(β-crosslaps，β-CTx)采用cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑檢測(cè)，儀器及試劑購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司(上海，中國(guó))。骨堿性磷酸酶通過(guò)凝集素親合法手工測(cè)定，試劑由中生金域診斷技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))提供。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作均嚴(yán)格遵照所用試劑操作說(shuō)明書(shū)及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(SOP)文件進(jìn)行，所有標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)2次，批間及批內(nèi)誤差均＜5%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene's檢驗(yàn)分析計(jì)量資料數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性；正態(tài)分布資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布以[M(Q)]表示，組間水平差異采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)；繪制受試者工作曲線(ROC)，通過(guò)曲線下面積(AUC)評(píng)估并比較各指標(biāo)診斷RA的價(jià)值，通過(guò)logistic回歸模型建立2個(gè)或多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合，比較診斷價(jià)值；各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試對(duì)象人口學(xué)特征及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的比較 所有研究對(duì)象人口學(xué)特征及血清RF、anti-CCP和14-3-3η檢測(cè)結(jié)果如表1所示。各組性別及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)Kruskal-Wallis及事后Nemenyi檢驗(yàn)分析，RA組血清RF、anti-CCP和14-3-3η水平明顯高于non-RA組和健康對(duì)照組(P＜0.01)，且non-RA組RF和14-3-3η水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 14-3-3η單獨(dú)或聯(lián)合RF和(或)anti-CCP對(duì)RA的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果分析顯示，14-3-3η、RF和anti-CCP診斷RA的AUC分別為0.845，0.807和0.878，3個(gè)指標(biāo)兩兩聯(lián)合或3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合可提高診斷價(jià)值(圖1)。在2.60ng/ml截?cái)帱c(diǎn)時(shí)，14-3-3η診斷RA的敏感性和特異性分別為62.83%和92.21%。

2.3 不同14-3-3η水平組RA患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較 根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，選取2.6ng/ml為截?cái)帱c(diǎn)將RA患者根據(jù)血清14-3-3η水平分為3組：＜2.6ng/ml組(n=43)，2.6～5.0ng/ml組(n=43)和＞5.0ng/ml組(n=27)。結(jié)果顯示，3組RA患者RF、anti-CCP、CRP、ESR、28關(guān)節(jié)活動(dòng)度評(píng)分(28 joint disease activity score，DAS28)及PINP、β-CTx和OC等骨代謝指標(biāo)中僅PINP和β-CTx在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

2.4 RA患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析 對(duì)113例RA患者所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，血清RF水平與anti-CCP水平相關(guān)系數(shù)(r)為0.732(P＜0.001)，14-3-3η與PINP及β-CTx強(qiáng)相關(guān)，r分別為0.817和0.808(P＜0.001，表3)。

表1 各組受試對(duì)象人口學(xué)特征及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 Demographics and laboratory results of subjects in each group

圖1 14-3-3η、RF、anti-CCP及其聯(lián)合診斷RA的ROC曲線Fig.1 ROC curve of 14-3-3η,Rheumatoid facto,anti-CCP and their combination for Rheumatoid arthritis diagnosis AUC.Area under curve; RF.Rheumatoid factor; anti-CCP.Anti-cyclic citrulline polypeptide antibody

表2 不同14-3-3η水平組RA患者血清檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of serum test results among RA patients with different serum levels of 14-3-3η protein

表3 RA患者血清學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析(r)Tab.3 Correlation analysis of serum indices in patients with RA (r)

3 討 論

RA疾病管理的關(guān)鍵在于早期診斷并及時(shí)進(jìn)行合理治療，延緩疾病進(jìn)程[8]。目前，影像學(xué)檢查及血清學(xué)檢測(cè)RF和anti-CCP結(jié)合臨床表現(xiàn)是臨床診斷RA的主要手段[9]，但仍有部分癥狀不典型及血清學(xué)陰性的患者由于誤診或漏診而延誤治療[1]。14-3-3η已被證實(shí)在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中明顯升高，對(duì)其診斷及鑒別診斷具有一定價(jià)值。Maksymowych等[10]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，血清14-3-3η水平(ng/ml)在早期RA組(0.76ng/ml)和非早期RA組(1.12ng/ml)均明顯高于健康人群(0.00ng/ml)和疾病對(duì)照組(0.02ng/ml)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，選取≥0.19ng/ml為截?cái)帱c(diǎn)時(shí)，非早期RA組與健康對(duì)照相比，AUC為0.89(95%CI 0.85～0.93)，敏感性和特異性分別為77.0%和92.6%，將非早期RA患者與所有對(duì)照人群(健康人群及疾病對(duì)照人群)對(duì)比，14-3-3η診斷RA的敏感性和特異性分別為77.4%和86.0%。本研究結(jié)果顯示，血清14-3-3η蛋白水平在RA組(3.26ng/ml)明顯升高(P＜0.05)，且非RA組(1.84ng/ml)也明顯高于健康對(duì)照組(0.27ng/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明炎性關(guān)節(jié)病變尤其是RA患者血清14-3-3η蛋白水平確有升高，可能與疾病的發(fā)生有關(guān)；經(jīng)ROC曲線分析，14-3-3η診斷RA的AUC為0.845(0.797～0.893)，診斷價(jià)值高于RF[0.807(0.751～0.862)]，而略低于anti-CCP[(0.878(0.830～0.926)]。當(dāng)截?cái)嘀禐?.60ng/ml時(shí)，14-3-3η對(duì)RA診斷的敏感性和特異性分別為62.83%和92.21%。以上結(jié)論與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論基本一致[10-12]，血清14-3-3η水平略有差異，可能由試劑盒差異所致。RF和anti-CCP是臨床常用于RA診斷和分類的生物標(biāo)記物。本研究隨后評(píng)估了聯(lián)合14-3-3η、RF和(或)anti-CCP后對(duì)RA的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，3項(xiàng)指標(biāo)兩兩聯(lián)合或3者聯(lián)合后診斷RA的AUC均變大，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合后AUC最大為0.907，而14-3-3η聯(lián)合anti-CCP的AUC甚至超過(guò)臨床常用的RF與anti-CCP聯(lián)合(0.900vs.0.875)，與Maksymowych等[10]的結(jié)論基本一致。Carrier等[13]的研究表明，高水平14-3-3η聯(lián)合自身抗體陽(yáng)性結(jié)果能夠增加RA的檢出率，該研究中增加的24例至少一項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性的患者中，有20例雖然自身抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，但是已經(jīng)達(dá)到1978或2010年制定的RA診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明14-3-3η蛋白水平對(duì)RA患者的診斷確實(shí)具有一定的價(jià)值，尤其可以減少血清學(xué)陰性患者的漏診和誤診。

RA通常表現(xiàn)為對(duì)稱性小關(guān)節(jié)慢性炎癥，隨著疾病進(jìn)展突破關(guān)節(jié)滑膜、侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)，患者晚期可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能受損[14]。此外，RA還是發(fā)生繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)的重要原因[15-16]，發(fā)展為OP的RA患者極易發(fā)生骨折甚至導(dǎo)致患者殘疾[17]。14-3-3蛋白是一個(gè)高度保守的酸性蛋白家族，結(jié)構(gòu)上的兩性凹槽使得該蛋白能與胞內(nèi)200多種配體蛋白結(jié)合[18-19]，在多種生命活動(dòng)調(diào)節(jié)和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，功能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)與黏附、凋亡、免疫炎癥、腫瘤發(fā)生等。本研究通過(guò)對(duì)比不同14-3-3η蛋白濃度RA患者的骨代謝指標(biāo)水平探討14-3-3η與RA患者骨代謝水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PINP和β-CTx在高14-3-3η組明顯高于低水平組，且經(jīng)Pearson相關(guān)分析PINP和β-CTx與14-3-3η高度相關(guān)(r分別為0.817和0.808)。PINP和β-CTx是常用的骨代謝指標(biāo)，用于指示機(jī)體骨質(zhì)破壞及修復(fù)狀態(tài)[20-21]。PINP是膠原合成及轉(zhuǎn)化過(guò)程中前膠原分子氨基末端分解產(chǎn)物，能反映Ⅰ型膠原代謝狀態(tài)；而β-CTx是Ⅰ型膠原分解產(chǎn)物，是反映骨吸收的重要標(biāo)志物，提示14-3-3η可能與RA患者骨代謝狀態(tài)相關(guān)，高14-3-3η蛋白水平患者可能更易發(fā)生骨代謝紊亂和骨質(zhì)疏松。Maksymowych等[4]研究證實(shí)14-3-3η能劑量依賴性地誘導(dǎo)與RA直接相關(guān)的炎性因子如：白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-9和核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表達(dá)，且與RA關(guān)節(jié)損傷有關(guān)，但其具體機(jī)制未知。此外，多種MMPs已經(jīng)被證實(shí)參與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)退變，進(jìn)而參與如OA和RA等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[22-23]。以上證據(jù)表明14-3-3η可能通過(guò)誘導(dǎo)MMPs高表達(dá)進(jìn)而降解膠原成分，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)造成損傷，甚至改變患者全身骨代謝狀態(tài)，而其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。CRP、ESR及DAS28是反映RA患者疾病活動(dòng)度的常用指標(biāo)，本研究未發(fā)現(xiàn)14-3-3η水平與三者相關(guān)，提示14-3-3η可能不是反映疾病活動(dòng)度的良好指標(biāo)。

綜上所述，血清14-3-3η蛋白檢測(cè)對(duì)RA的診斷鑒別具有臨床價(jià)值，并且聯(lián)合RF和(或)anti-CCP檢測(cè)可提高RA診斷效能。此外，14-3-3η蛋白血清水平與RA患者骨代謝水平存在關(guān)聯(lián)，可作為RA輔助診斷和病情監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)。