李文崢 侯志廣*

（1 廣東邊防武警總隊(duì)醫(yī)院中藥房，廣東 深圳 518000；2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長春 130118）

人參（Panax ginseng C.A.Meyer.）為五加科人參屬植物的干燥根，它與三七、西洋參等著名藥用植物是近親。產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江、河北（霧靈山、都山）、山西、湖北等地，人參具有卓越及獨(dú)特的藥用價(jià)值[1-3]，經(jīng)藥理學(xué)驗(yàn)證，皂苷是其主要的活性成分，因此皂苷的含量高低決定了其品質(zhì)。因此，建立一個(gè)簡單、經(jīng)濟(jì)、有效、能同時(shí)檢測多種皂苷的分析方法意義重大。目前人參皂苷分析方法主要有：HPLC、GC、TLCS、MS、HPCE、分光光度法、比色法、薄層光密度法、棒狀薄層掃描法、酶免疫分析法、液滴逆流色譜法等[4-7]。借助高效液相色譜法，本實(shí)驗(yàn)測定了人參中9種皂苷的含量，以期為人參的質(zhì)量控制與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定等提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1200，四元泵，DAD檢測器，美國安捷倫公司）；HP Chemstation 化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；LD-06A型高速中藥粉碎機(jī)；人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf均購自中國藥品生物制品檢定所；固相萃取柱SPE C18（1000 mg填料）；人參購于吉林省撫松縣，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部參茸中心鑒定為人參（Panax ginseng C.A.Meyer.）的干燥根；甲醇為色譜純，其他均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為一級水，所有試劑均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾及超聲脫氣處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 優(yōu)化條件

2.1.1 洗脫液配比的優(yōu)化：為了明確洗脫效果，通過對不同體積配比的乙醇和水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，論證表明，70%乙醇水溶液是最優(yōu)洗脫液配比溶液，既能確保回收率，又會減少被洗脫的雜質(zhì)組分。

2.1.2 洗脫液體積的優(yōu)化：用40 mL體積的70%乙醇溶液做為洗脫劑洗脫，分段接收洗脫液，同時(shí)測定，其結(jié)果表明用25 mL 70%乙醇溶液做為洗脫劑，檢測回收率符合要求。

2.1.3流動(dòng)相的優(yōu)化：人參試樣，成分復(fù)雜，干擾較多，易出現(xiàn)假陽性的情況。采用水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，調(diào)整流動(dòng)相比例，使用不同的流速對樣品檢測，優(yōu)化選擇，結(jié)果表明上述梯度洗脫程序?yàn)榉治龅淖罴严疵摮绦?，在該條件下分析測試，待測組分皂苷與試樣中雜質(zhì)得到較好的分離和滿意的收率，避免出現(xiàn)假陽性的情況。

2.2 色譜條件：色譜柱為ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DAD檢測器；柱溫為47 ℃；檢測波長202 nm；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.5～0.8 mL/min；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，52%A，48% B，流速0.5 mL/min；20～23 min 52%～57% A，43%～48% B，流速0.5～0.8 mL/min，23～36 min 57%A，43% B，流速0.8 mL/min；36～39 min 57～65% A，43%～35%B，流速0.8 mL/min；39～71 min 65%A，35%，B流速0.8 mL/min；71～74 min 65%～52% A，35%～48%B，流速0.8～0.5 mL/min；74～84 min 52% A，48%B流速0.5 mL/min。9種人參皂苷混合對照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，得到其分離色譜圖及9種人參皂苷樣品色譜圖1，9種人參皂苷樣品色譜圖見圖2。

圖1 9種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（1-Re；2-Rg1；3-Rf；4-Rg2；5-Rb1；6-Rc；7-Rb2；8-Rb3；9-Rd）

圖2 9種人參皂苷樣品色譜圖（1-Re；2-Rg1；3-Rf；4-Rg2；5-Rb1；6-Rc；7-Rb2；8-Rb3；9-Rd）

2.3 對照品溶液的制備：精密量取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf對照品適量。用甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 樣品提取：準(zhǔn)確稱取人參樣品2 g（精確至0.001 g），加入100 mL乙醚于索氏提取器中，提取1 h，棄去乙醚，待殘?jiān)幸颐褤]干后，再加入甲醇回餾8 h。

2.4.2 樣品凈化

2.4.2.1 SPE C18柱的預(yù)處理：先用10 mL去離子水淋洗SPE C18柱，然后用10 mL的甲醇進(jìn)行活化，再用10 mL 去離子水平衡。待水與柱篩板近平時(shí)上樣。

2.4.2.2 提取液的處理：提取液在60 ℃水浴條件下，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干，氮?dú)獯蹈桑尤? mL去離子水充分搖勻。取2 mL樣液注入預(yù)先活化好的SPE C18柱中，待液面與柱篩板近平時(shí)，倒入10 mL去離子水淋洗SPE C18柱，棄去流出液，待淋洗液液面與柱篩板近平時(shí)，加入25 mL乙醇溶液（4.1）洗脫SPE C18柱，收集洗脫液于50 mL刻度試管中，氮?dú)獯抵?5 mL以下，用甲醇定容至25 mL，混勻后，用0.2 μm濾膜過濾，備用。

2.5 線性關(guān)系：精密量取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf對照品適量。采用甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對各種皂苷體的峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（x，mg/L）進(jìn)行線性回歸分析，得到相應(yīng)人參皂苷的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 9種人參皂苷的線性回歸方程

2.6 精密度試驗(yàn)：精密吸取不同人參皂苷的對照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，9種人參皂苷面積的RSD在0.82%～1.75%，表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取5份同一批號的人參樣品，獲得不同人參皂苷體的含量，對應(yīng)RSD為0.98%～2.87%。表明本方法的重復(fù)性較好。

2.8 回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取人參樣品2 g索氏提取器中，加入一定量皂苷對照品混合溶液，重復(fù)5份，對應(yīng)的回收率、RSD結(jié)果見表2。

表2 9種人參皂苷的加樣回收率結(jié)果（n=3）

3 討 論

人參中的成分比較復(fù)雜，在色譜分離實(shí)驗(yàn)中，通過對流動(dòng)相及其比例的優(yōu)化篩選，最終樣品在甲醇和水梯度洗脫的條件下，9種皂苷能夠較好地分離。在樣品凈化時(shí)采用SPE柱，凈化效果較好，減少了雜質(zhì)的干擾?？偟膩碚f，該方法準(zhǔn)確，快速，重現(xiàn)性好，靈敏度高，精密度也較好。便于快速分析，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

作為最常見的中藥材，人參皂苷含量的個(gè)體差異較大，該方法的建立對人參的品質(zhì)評價(jià)有重要的參考意義。