朱健偉 李益飛 王兆濤 賈偉強(qiáng) 陳晨 顧應(yīng)江 胡蓉 徐如祥

小腦作為掌管運(yùn)動(dòng)平衡、協(xié)調(diào)隨意運(yùn)動(dòng)、維持步態(tài)姿勢(shì)的重要中樞被人們所熟知，這與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。小腦皮層由蒲肯野細(xì)胞層（purkinje cell layers，PL）及其外側(cè)的分子層（molecular layers，ML）和內(nèi)側(cè)的顆粒細(xì)胞層（granule cell layers，GCL）共同構(gòu)成一個(gè)“三明治樣”的結(jié)構(gòu)，蒲肯野細(xì)胞的胞體平行排列于PL，其發(fā)出的樹突分支延伸到ML，而其軸突則延伸到有顆粒細(xì)胞構(gòu)成的GCL。此外，在蒲肯野細(xì)胞的胞體周圍還定居著伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞，其胞體位于PL，而膠質(zhì)纖維則延伸到ML[1]。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種跨膜類識(shí)別受體，在先天性免疫反應(yīng)中具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)免疫性疾病中都有重要的作用，而Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在這其中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[2-4]。曾有研究證實(shí)，TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中，然而近年來TLR4逐漸被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)前體細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）和神經(jīng)元中均有表達(dá)，其作用涵蓋了神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性病變的發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)可塑性，并且參與了成年海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生[5-11]。然而上述研究主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦部分，對(duì)TLR4在小腦中的作用卻未曾闡述。因而，本研究主要通過免疫熒光染色的方法率先探索TLR4在小腦組織中的表達(dá)，為后期揭示TLR4在小腦功能中的作用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組管理

選取6月齡大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窩對(duì)照的野生型（TLR4+/+）小鼠作為研究對(duì)象。TLR4-/-小鼠購自南京大學(xué)動(dòng)物模式中心，經(jīng)與野生型小鼠雜交后得到雜合子（TLR4+/-）小鼠。然后通過TLR4+/-小鼠交配繁殖得到實(shí)驗(yàn)所用的TLR4-/-小鼠及其同窩對(duì)照的TLR4+/+小鼠。所有小鼠均飼養(yǎng)于12 h晝夜周期的標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)，且給予充足的水和食物。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

TLR4抗體ab13556（Abcam公司，美國）；鈣結(jié)合蛋白抗體300（Swant公司，瑞士）；離子鈣接頭蛋白（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1） 抗體ab5076（Abcam公司，美國）；性別決定區(qū)Y盒2號(hào)蛋白（sex determination region Y-box 2，Sox2）抗體 sc-17320（Santa Cruz公司，美國）；神經(jīng)元特異核蛋白（neuron specific nuclear protein，NeuN）抗體ab104224（Abcam 公司，美國）。 萊卡冰凍切片機(jī)（CM1950，德國）；萊卡激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5，德國）。

三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組管理

實(shí)驗(yàn)所用小鼠根據(jù)DNA鑒定結(jié)果分為TLR4-/-組和TLR4+/+組，TLR4+/+組小鼠小腦組織用于抗體陽性染色，而TLR4-/-組小鼠小腦組織作為抗體陰性對(duì)照染色。

四、標(biāo)本制備

6月齡大小的小鼠，經(jīng)3.6%的水合氯醛麻醉后心臟灌注磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），待全身血液被置換出以后給予4%的多聚甲醛灌注。完整取出小鼠腦組織并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定，24 h后用蔗糖溶液（10%、20%、30%）進(jìn)行梯度脫水。分離小腦組織，以25 μm的厚度進(jìn)行冰凍切片，并收集于載玻片上。

五、免疫熒光染色

冰凍切片于空氣中干燥15 min后，放入PBS溶液中搖晃清洗5 min，后放入含有0.3%辛基酚聚氧乙烯醚溶液的PBS中搖晃10 min×3次，隨即用10%的胎牛血清溶液于室溫下封閉1 h。棄去封閉液后加入稀釋好的一抗液（TLR4、鈣結(jié)合蛋白、Iba-1、Sox2、NeuN 等一抗）于 4℃下孵育 16～18 h，PBS搖晃清洗后加入稀釋好的二抗溶液并于室溫下孵育1 h。PBS 搖晃清洗 10 min×3 次， 用 4’，6-二脒基-2-苯基吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封 片 劑進(jìn)行封片，而后于激光共聚焦下拍攝獲取一抗表達(dá)的熒光圖像，并分析TLR4的細(xì)胞定位及其與不同細(xì)胞Marker的共定位。

結(jié) 果

一、TLR4高表達(dá)于小腦蒲肯野細(xì)胞層

通過免疫熒光染色的方法，可發(fā)現(xiàn)TLR4在小腦組織中高表達(dá)于PL，而在ML和GCL中則沒有明顯的表達(dá)。而后通過與蒲肯野細(xì)胞特異的標(biāo)記蛋白——鈣結(jié)合蛋白共染發(fā)現(xiàn)TLR4高表達(dá)于鈣結(jié)合蛋白陽性的蒲肯野細(xì)胞胞漿中，而在樹突分支中則沒有表達(dá)。詳細(xì)信息見圖1。

圖1 免疫熒光染色檢測(cè)Toll樣受體4在小腦蒲肯野細(xì)胞中的表達(dá)

二、TLR4在伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞中的表達(dá)

通過免疫熒光共染，發(fā)現(xiàn)Sox2陽性的伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）和NeuN陽性的顆粒細(xì)胞中均沒有TLR4 的表達(dá)（圖 3）。

三、TLR4在小腦小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

將TLR4與小膠質(zhì)細(xì)胞特異的標(biāo)記蛋白——Iba-1進(jìn)行共染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有極少部分的小腦小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TLR4（圖4）。

四、TLR4在TLR4-/-小鼠小腦組織中的表達(dá)

采用TLR4-/-的小腦組織進(jìn)行陰性對(duì)照染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4抗體在TLR4-/-的小腦組織中未見明顯陽性表達(dá)信號(hào)（圖5）。

討 論

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)Toll樣受體4在小腦伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)；圖3免疫熒光染色檢測(cè)Toll樣受體4在小腦顆粒細(xì)胞中的表達(dá)；圖4免疫熒光染色檢測(cè)Toll樣受體4在小腦小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)Toll樣受體4在TLR4-/-小腦組織中的表達(dá)

TLR4不僅是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，同時(shí)也是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要分子，其廣泛參與神經(jīng)性疼痛以及神經(jīng)退行性病變[9，10]。通過減輕炎癥反應(yīng)，TLR4還能夠保護(hù)缺血性損傷所致的海馬神經(jīng)元凋亡，參與海馬區(qū)的神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)和神經(jīng)發(fā)生[7，11，12]。 這些研究揭示了 TLR4 在神經(jīng)系統(tǒng)中的非免疫性功能，且一定程度上預(yù)示了TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)揮中的重要作用，然而以上研究主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦部分，對(duì)于小腦的研究卻未曾被揭示。

小腦的功能主要是調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)平衡和協(xié)調(diào)動(dòng)作的執(zhí)行，而這其中最關(guān)鍵的細(xì)胞是蒲肯野細(xì)胞，是小腦皮層中唯一的信號(hào)輸出神經(jīng)元，對(duì)于小腦功能的執(zhí)行有著不可替代的作用[13-16]。本實(shí)驗(yàn)率先發(fā)現(xiàn)了TLR4高表達(dá)于小腦的蒲肯野細(xì)胞中，這預(yù)示了TLR4在小腦功能執(zhí)行中可能發(fā)揮了重要的作用。蒲肯野細(xì)胞的胞體位于PL，然其樹突發(fā)出的分支卻伸向ML，遠(yuǎn)端的樹突分支與顆粒細(xì)胞軸突上行到分子層形成平行纖維-蒲肯野細(xì)胞突觸連接；而近端樹突分支則與延髓橄欖核發(fā)出的攀緣纖維形成攀緣纖維-蒲肯野細(xì)胞突觸連接。蒲肯野細(xì)胞通過以上兩種突觸連接接收興奮性信號(hào)的輸入，經(jīng)整合之后輸出到前庭小腦核和深部小腦核，以完成小腦功能的執(zhí)行[17]。因此，顆粒細(xì)胞對(duì)于蒲肯野細(xì)胞為核心的小腦功能執(zhí)行也有著重要的作用。而在小腦的PL中，伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞作為蒲肯野細(xì)胞的“鄰居”，其發(fā)出的膠質(zhì)纖維進(jìn)入ML與蒲肯野細(xì)胞的樹突分支緊密連接，形成支架樣的作用供蒲肯野細(xì)胞樹突分支的延伸，進(jìn)而保證蒲肯野細(xì)胞充分的突觸連接以發(fā)揮其功能，因此伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于蒲肯野細(xì)胞的功能執(zhí)行也有著非常重要的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)同樣分析了TLR4在顆粒細(xì)胞和伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)TLR4并沒有表達(dá)于顆粒細(xì)胞和伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞中。初步判斷TLR4在小腦功能執(zhí)行中的作用主要是通過影響蒲肯野細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。

先前大量研究證實(shí)，TLR4作為免疫反應(yīng)過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)同樣分析了TLR4在小腦小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示只有極少部分的小膠質(zhì)細(xì)胞中有TLR4的表達(dá)，這說明TLR4在小腦中的作用可能并未明顯涉及到免疫相關(guān)，反而其非免疫性的神經(jīng)功能值得更深入的研究。為了進(jìn)一步證實(shí)，筆者采用了TLR4-/-的小腦組織進(jìn)行對(duì)照染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4抗體在TLR4-/-的小腦組織中未見明顯陽性表達(dá)信號(hào)，這既驗(yàn)證了所用抗體的特異性，也證實(shí)了以上結(jié)果的可靠性。

綜上所述，本研究將免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中的經(jīng)典信號(hào)分子TLR4進(jìn)行了小腦組織學(xué)表達(dá)情況的初步探索，明確了其高表達(dá)于蒲肯野細(xì)胞，這對(duì)于后期揭示其在小腦功能中的作用具有重要的啟示作用，同時(shí)對(duì)于探索TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)中的非免疫性作用也有重要的意義。