黎運呈 王 艷 王秋景 盛國光 高 莉△

1.浙江省舟山醫(yī)院感染科 (浙江 舟山， 316004) 2.湖北省中醫(yī)院

隨著目前飲食習慣的改變，脂肪肝的發(fā)病率逐年升高，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化等一系列變化[1～3]。肝臟是機體脂質代謝的中心器官,也是內源性和外源性脂肪代謝的交匯點和調節(jié)中樞,肝細胞內甘油三酯的沉積是形成NAFLD的先決條件。山楂葉總黃酮(HLF)是從薔薇科植物山楂的干燥葉中提取的黃酮類化合物，現代藥理學研究表明，山楂葉總黃酮具有降低血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[4]。本實驗通過觀察山楂葉總黃酮對NAFLD細胞模型病理及血脂的影響，探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗用藥物與細胞系 山楂葉總黃酮(HLF)(長春三九生物制藥，批號:20140823)；水飛薊素膠囊(商品名:利加隆，批號:20140112，德國馬博士大藥廠生產)。人正常肝細胞L-02株，購自中科院上海細胞研究所細胞庫。

1.2 化學藥品與試劑 胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司;油酸(OA)購自天津風船化學試劑科技有限公司;軟脂酸(PA)、油紅O、二甲基亞砜(DMSO)、SDS-PAGE試劑、RNA酶購自美國Sigma公司;達氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)和小牛血清(FCS)購于Gibco公司;甘油三酯(TG)試劑盒、超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶測試盒、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)購于羅氏公司。

1.3 實驗儀器 全自動酶標儀，Powerwave X340，美國Bio-Tek公司；圖像獲取系統(tǒng)，Olympus DP71；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo；倒置顯微鏡，日本Olympus；超低溫冰箱，MDF-382ECM；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人正常肝L-02細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃、含5%CO2的溫箱中培養(yǎng)72h,細胞70%～80% 融合時,以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化傳代,更換培養(yǎng)液。

1.4.2 建立NAFLD細胞模型 上述培養(yǎng)細胞換液時，換成含有1mmol/L 游離脂肪酸(FFA)混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液,誘導24h、48h、72h,收集細胞,分別進行油紅O染色、顯微鏡觀察、計算細胞活力和TG測定等，細胞模型。

1.4.3 NAFLD細胞分組 實驗分為正常組、模型組、水飛薊素組和山楂葉總黃酮(HLF)組共4組，每組分4個培養(yǎng)瓶，正常組用MEM培養(yǎng)液換液,而模型組、水飛薊組和HLF組換液時換成含有1mmol/L FFA混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液誘導，其中水飛薊素組加入150μg/ml的水飛薊干預，HLF組加入400μg/ml的HLF干預。實驗重復5次。

1.4.4 MTT檢測抑制率 取對數生長期的細胞(1×105個/孔)種植于96孔培養(yǎng)板24h孵育后，各治療組藥物作用L-02細胞共48h，取出培養(yǎng)板，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震蕩10min使結晶充分溶解，酶標儀在波長490nm條件下測每孔吸光度。實驗重復5次。

1.4.5 電鏡檢測 各治療組藥物作用L-02細胞共48h，收集細胞，PBS清洗細胞2次，加2.5%戊二醛固定24h，送浙江大學測試中心電鏡室進行透射電鏡標本的制備及觀察。

1.4.6 觀察指標檢測 觀察根據試劑盒提供方法檢測甘油三酯(TG)、Na+-K+-ATP酶及超微量Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力。

2 結果

2.1 HLF對NAFLD細胞生長的影響 NAFLD細胞培養(yǎng)48 h測各組OD值，各組間比較，模型組內細胞的生長抑制率最高，與HLF組比較有極顯著性差異(P<0.01)，提示模型組內細胞生長明顯受抑制，藥物干預后，細胞生長抑制狀況能有不同程度緩解。見表1。

表1 HLF對NAFLD細胞抑制率的影響

2.2 電鏡檢測結果 正常組肝細胞結構清晰，細胞器結構完整，肝細胞線粒體豐富，形態(tài)正常，膜與嵴連續(xù)完整，嵴排列整齊，基粒完整；未見明顯異常病變。模型組肝細胞內線粒體體積增大，明顯水腫，嵴斷裂，甚至消失，基粒脫落，基質內可見多個亮區(qū)，外膜有破裂現象，線粒體混濁腫脹明顯；細胞核的形狀不規(guī)則，呈鋸齒形，出現核固縮碎裂現象，細胞呈凋亡特征性改變。HLF組肝細胞內各細胞器可見，核內染色質均勻，核周間隙清晰，部分線粒體腫脹，線粒體嵴可見，排列紊亂，膜完整，可見線粒體增生分裂現象。水飛薊素組內肝細胞可見各細胞器，細胞核異染色質增多，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴紊亂、消失，基粒脫落，可見亮區(qū)；線粒體可見膜邊緣模糊，部分膜破裂，線粒體受損。見插頁彩圖1。

2.3 各組細胞TG含量的變化 在6h、12h、24h、48h各時間點，各組細胞TG含量的比較，均有極顯著性差異(見表2)。

表2 各組細胞TG結果比較

2.4 各組細胞超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化 在6h、12h、24h、48h各時間點，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性各組間比較，均有極顯著性差異(見表3、表4)。

表3 各組細胞Na+-K+-ATP酶活性結果比較

表4 各組細胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性結果比較

3 討論

NAFLD是由于肝臟內堆積的脂肪過多，造成肝臟脂肪變性。NAFLD患者通常伴有肝細胞損傷和肝臟炎癥，稱為NASH。NAFLD和NASH已成為西方國家頭號肝病，其發(fā)病率在20年內增加了1倍。當疾病進展為NASH時患肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的風險增加，且NASH引起的肝硬化和因肝病死亡的發(fā)生率在近10年分別在20%和12%以上，因此，研究NAFLD的機制及防治藥物，阻止或延緩其發(fā)生發(fā)展意義重大[5,6]。因NAFLD/NASH的確切病因尚未取得統(tǒng)一意見，目前西醫(yī)對于NAFLD/NASH缺乏有效的治療方法，而中醫(yī)藥根據脂肪肝以濕熱內蘊、脾虛濕痰、痰瘀互結為基本證型的特點，采用祛濕化痰，活血等治法能明顯改善脂肪肝的臨床癥狀及肝功能、血脂、血糖等多項指標，改善肝臟微循環(huán)，促進受損肝細胞的恢復。中醫(yī)藥在治療過程中無明顯不良反應，因而成為治療脂肪病肝性的特色和優(yōu)勢[7、8]。

山楂葉為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉，有活血化瘀、化濁降脂等功能，現代藥理學研究表明山楂葉總黃酮(HLF)具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化應激、抗血小板凝聚、抗細胞凋亡等作用[9、11]。本實驗結果顯示，模型組內肝細胞的生長受到抑制，通過HLF干預后，肝細胞生長抑制狀況有不同程度的緩解，與模型組比較有顯著性差異?？梢?，肝細胞在脂肪酸的持續(xù)刺激作用下生長受到抑制，山楂葉總黃酮能有效緩解NAFLD所致的肝細胞生長抑制，隨著濃度增加，緩解生長抑制的效果明顯。模型組中TG在各個時間點均持續(xù)升高，在HLF的作用下，TG明顯下降，與模型組比較有極顯著性差異。超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶屬于ATP 酶系統(tǒng)，ATPase是一類與細胞功能密切相關的化學酶，在能量的轉換，離子的運輸及信號傳遞等方面發(fā)揮著巨大的作用[12]。Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP存在于細胞膜上， 有離子載體的作用，能起到調節(jié)細胞膜兩側的電位平衡、組織滲透壓，為細胞各種功能活動提供能量，本實驗研究發(fā)現，HLF組中Na+-K+-ATP在48h時間點上活性最高，與模型組及水飛薊素組比較有極顯著性差異(P<0.01)，HLF組中Ca2+-Mg2+-ATP在各個時間點上的活性，與模型組比較均有極顯著性差異(P<0.01)，由實驗結果可知，HLF能降低NAFLD對細胞生長的抑制率，降低TG，提高Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP的活性。

線粒體是肝細胞最重要的細胞器之一，提供了細胞所需的90%以上能量。肝細胞的脂肪變與線粒體氧化功能的改變密切相關，線粒體的脂肪酸β氧化受損在肝臟脂肪變的過程中起主要作用，凡是干擾了線粒體功能和脂肪酸代謝的因素，都將導致肝臟脂肪變[13～15]。從超微病理圖片分析，模型組肝細胞內線粒體體積增大混濁腫脹明顯，嵴斷裂，甚至消失，基粒脫落，基質內可見多個亮區(qū)，外膜有破裂現象，細胞核鋸齒形改變，有核固縮現象；藥物治療組肝細胞內細胞器可見，線粒體部分腫脹，線粒體嵴可見，膜完整，與模型組比較，線粒體形態(tài)變化明顯得到改善。實驗結果表明，山楂葉總黃酮對肝細胞的能量發(fā)生器—線粒體能起到保護作用。我們推測山楂葉總黃酮保護肝細胞線粒體的這一特點可能是通過其降脂、抗凋亡、提高細胞關鍵酶的活性等綜合作用而達到的。山楂葉總黃酮能有效改善肝細胞細胞器的形態(tài)，降低血脂，維護肝細胞的功能，進而干預脂肪肝的發(fā)展進程。