郝俊杰，李磊，王波，秦玉紅，崔健，王瑛，王佩圣，江志訓(xùn)，孫吉祿，王珍青，岳歡，張守才

（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島 266100）

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativusL.）是主要的蔬菜之一，在世界各地廣泛栽培。而白粉病是危害黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一，對(duì)白粉病抗性基因的精細(xì)定位是克隆抗性基因并建立白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種體系的基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】由于白粉病病原菌種類(lèi)或生理小種不明確、實(shí)驗(yàn)材料各異、鑒定方法和病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不同等因素，造成黃瓜白粉病抗性遺傳規(guī)律研究結(jié)論存在較大差異，主要有以下4種觀點(diǎn)。第一種觀點(diǎn)認(rèn)為黃瓜白粉病抗性是由隱性多基因控制，且為數(shù)量性狀[1-2]。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為黃瓜白粉病抗性是由隱性單基因控制[3-4]。第三種觀點(diǎn)認(rèn)為黃瓜白粉病抗性是由1對(duì)不完全隱性基因和2對(duì)上位修飾基因控制[5-8]。第四種觀點(diǎn)認(rèn)為黃瓜白粉病抗性是由顯性基因控制[9]。目前，對(duì)于黃瓜白粉病基因的定位研究已有較多的報(bào)道[10-13]。例如，沈麗平[10]采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測(cè)到2個(gè)白粉病抗性QTL位點(diǎn)，位于第3連鎖群上，貢獻(xiàn)率分別為7.6%和13.5%。劉龍洲等[12]在兩種環(huán)境里共檢測(cè)到4個(gè)分布于連鎖群1、2、4和6上的黃瓜白粉病抗性QTL，單個(gè)QTL解釋貢獻(xiàn)率介于5.2%—21.0%。張圣平等[13]檢測(cè)到一個(gè)位于 5號(hào)染色體上的QTL（Pm5.2），并認(rèn)為其為主效QTL位點(diǎn)，此位點(diǎn)與SSR00772緊密連鎖?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SNP標(biāo)記的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，也隨之產(chǎn)生了基于全基因組測(cè)序的 BSA-seq技術(shù)。該技術(shù)極大程度的提高了基因定位的準(zhǔn)確性和效率，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)運(yùn)于藜麥、水稻、鷹嘴豆等作物中[14-16]，而在黃瓜中鮮有報(bào)道。2009年黃瓜基因組全測(cè)序的完成，為在黃瓜中利用BSA-seq技術(shù)定位基因提供了序列基礎(chǔ)[17]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以高抗白粉病自交系‘74’和高感白粉病自交系‘80’為親本配置組合，構(gòu)建F2分離群體；并利用BSA分池法結(jié)合二代測(cè)技術(shù)進(jìn)行白粉病基因的初步定位；在此基礎(chǔ)上在進(jìn)一步在候選區(qū)段內(nèi)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，對(duì)白粉病抗性基因進(jìn)行精細(xì)定位。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2013年—2016年在青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料由青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所黃瓜課題組提供。母本自交系‘74’（簡(jiǎn)稱(chēng)74）為2003年從青島國(guó)際種苗有限公司引進(jìn)的華北型黃瓜種質(zhì)，為高抗白粉病的自交系；父本自交系‘80’（簡(jiǎn)稱(chēng)80）為2001年從日本引進(jìn)的華南型黃瓜種質(zhì)，是高感白粉病的自交系。74×80雜交獲得 F1種子，F(xiàn)1自交獲得233個(gè)F2單株。用于接種鑒定的病菌是單囊殼白粉菌Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.exFr.）Poll.），由青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所黃瓜課題組提供，2015年3—5月在青島市農(nóng)科院李滄試驗(yàn)基地進(jìn)行接菌鑒定。

1.2 黃瓜白粉病成株抗性鑒定

將黃瓜自交系‘74’、自交系‘80’以及雜交F1和 F2代種子浸泡催芽后播種于經(jīng)高溫滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中。黃瓜幼苗植株長(zhǎng)至5—6葉期，將其移栽至黃瓜塑料大棚內(nèi)。待黃瓜植株長(zhǎng)至14—15葉期時(shí)，用小型手持噴霧器將接種液均勻地、充分地噴在黃瓜整個(gè)植株葉片的正、反兩面，直至葉片透濕。接種后，大棚內(nèi)濕度控制在70%—80%，溫度控制在25—28℃，持續(xù)黑暗12—16 h后恢復(fù)正常光照，15 d后進(jìn)行病情調(diào)查。

植株病情鑒定方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考 2010年國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-黃瓜抗白粉病鑒定技術(shù)規(guī)程（NY/T1857.2—2010）[18]。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)病斑面積和感病程度分為6個(gè)級(jí)別：0級(jí)：無(wú)任何病癥；1級(jí)：病斑面積占葉面積的 1/3以下，白粉狀病斑模糊不清；3級(jí)：病斑面積占葉面積的 1/3—2/3，白粉狀病斑較為明顯，但分散不連片；5級(jí)：病斑面積占葉面積的2/3以上，白粉狀病斑連片，葉片開(kāi)始變黃；7級(jí)：白粉層濃厚，由葉緣向里變褐；9級(jí)：葉片變褐壞死斑面積占葉面積的2/3以上，葉緣上卷[18]。

1.3 黃瓜DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用改良的CTAB法[19]提取親本、F2單株基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將樣品稀釋到50 ng·μL-1備用。PCR 反應(yīng)體系 20 μL，含 100 ng基因組 DNA 2 μL、10×PCR 緩沖液 2 μL、25 mmol·L-1MgCl22 μL、20 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、2 μmol·L-1上下游引物各0.75 μL、1 U TaqDNA聚合酶0.05 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，51—54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min，4℃冰箱保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用 5%的變性聚丙烯酰胺凝膠 50 W 恒功率電泳分離，銀染顯色后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 抗感池的建立和及重測(cè)序

根據(jù)田間接種調(diào)查得到的黃瓜單株病情指數(shù)結(jié)果，從F2群體中選擇抗病性最好及感病最嚴(yán)重的極端材料構(gòu)建抗感池。抗感池包含20個(gè)單株，單株取其幼嫩葉片并提取DNA后，單株取等量DNA混合構(gòu)建抗感池。

將20 μg抗感池基因組DNA進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，采用Illumina Hiseq 2000測(cè)序儀進(jìn)行雙末端（pair-ended）測(cè)序，得到的讀長(zhǎng)為2×100 bp，要求獲得5 GB數(shù)據(jù)量（深圳華大基因）。

對(duì)質(zhì)量控制后的序列數(shù)據(jù)比對(duì)黃瓜參考基因組，獲得抗感池的SNP位點(diǎn)信息，計(jì)算SNP-index值[20]。

1.5 定位所用的分子標(biāo)記

本研究所用標(biāo)記包括兩部分。290對(duì)SSR標(biāo)記來(lái)源于高密度黃瓜SSR遺傳圖譜[21]。針對(duì)候選區(qū)段的序列在兩個(gè)親本間的差異，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)38對(duì)In/Del標(biāo)記[22]。

1.6 遺傳作圖

將候選染色體的分子標(biāo)記對(duì) F2群體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)各單株帶型，與自交系‘74’帶型一致的記為“A”，與自交系‘80’帶型一致的記為“B”，雜合記為“H”，缺少或不正常條帶均記為“-”。最后利用QTL IciMaping軟件計(jì)算分子標(biāo)記與目的基因之間的遺傳距離，并繪制連鎖圖譜[23]。

2 結(jié)果

2.1 表型鑒定與遺傳分析

本研究論文中選用的親本自交系‘74’對(duì)白粉病菌表現(xiàn)免疫（0級(jí)），而自交系‘80’對(duì)白粉病菌表現(xiàn)為感?。?級(jí)）（圖1）。為了分析自交系‘74’對(duì)白粉病成株抗性的遺傳，對(duì)F1植株接種白粉病菌，所有 F1植株均感白粉病，且具有與其感病親本自交系‘80’相似的侵染型（5級(jí)），介于雙親之間，說(shuō)明自交系‘74’對(duì)白粉病的抗性是不完全隱性的。F2群體單株的發(fā)病級(jí)別為1—9，平均值為4.55；其中1級(jí)發(fā)病植株占32.4%，3級(jí)發(fā)病植株占13.2%，5級(jí)發(fā)病植株占20.5%，7級(jí)發(fā)病植株占11.9%，9級(jí)發(fā)病植株占21.9%，F(xiàn)2群體中發(fā)病級(jí)別呈現(xiàn)連續(xù)分布。表明抗病親本中含有的抗病性狀可能是由數(shù)量性狀控制。

圖1 供試黃瓜抗感親本體接菌后表型（A：74；B：80）Fig. 1 Parents phenotypes after inoculation (A:74; B: 80)

2.2 抗性基因的初步定位

本研究中選擇F2群體中抗感極端材料各20株構(gòu)建白粉病抗感池。如圖2所示，在抗性池中，在第5染色體22—25 Mb區(qū)間SNP-index接近0，說(shuō)明該位點(diǎn)與參考基因組序列基本一致；而在感病池中在同一區(qū)間SNP-index接近1，說(shuō)明該位點(diǎn)與參考基因組序列存在序列差異。觀察兩個(gè)池在同一區(qū)間的 SNP-index值相減后得到Δ(SNP-index)數(shù)值，可以看出，22—25 Mb的Δ(SNP-index)值大于 0.5，并顯著大于0（P＜0.05）；15—20 Mb的Δ(SNP-index)值在0.25—0.35。由此，確認(rèn)第五號(hào)染色體15—25 Mb區(qū)段為白粉病抗性基因的候選區(qū)域，將該基因暫命名為PM74。

圖2 抗感池SNP檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Detection results with SNP markers in the resistant (Br) and susceptible (Bs) bulks

2.3 抗性基因的精細(xì)定位

為了進(jìn)一步定位PM74在5號(hào)染色體的位置，利用位于5號(hào)染色體的290個(gè)SSR標(biāo)記、38個(gè)In/Del標(biāo)記和12對(duì)PCR標(biāo)記，共篩選獲得在抗感親本間存在多態(tài)性的23對(duì)SSR標(biāo)記、10對(duì)In/Del標(biāo)記和2對(duì)PCR標(biāo)記，利用上述多態(tài)性標(biāo)記對(duì)F2單株進(jìn)行連鎖分析。結(jié)合F2單株抗病性表型分析，共預(yù)測(cè)到1個(gè)白粉病抗性相關(guān)QTL（PM74），位于標(biāo)記SSR15321和SSR07531之間，遺傳距離為3.06 cM，LOD值21.99，可解釋41.95%的表型變異（圖3）。利用GUGI提供基因組數(shù)據(jù)，標(biāo)記SSR15321位于5號(hào)染色體17 443 753—17 443 896位置；SSR07531位于5號(hào)染色體17 208 433—17 205 452位置，這與利用BSA混池測(cè)序鑒定的結(jié)果一致。最終將黃瓜抗白粉病基因PM74鎖定在5號(hào)染色體第17 443 896—17 205 452堿基之間，物理距離為238 444 bp。

2.4 候選基因的預(yù)測(cè)分析

結(jié)合Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋數(shù)據(jù)及NCBI比對(duì)，在候選區(qū)段內(nèi)預(yù)測(cè)到17個(gè)有功能注釋的基因（圖3和表1）。這些基因編碼的蛋白類(lèi)型包括MYB轉(zhuǎn)錄因子（Cucsa.275510）、植物自交不親和蛋白（Cucsa.275540和Cucsa. 275550）、PPR蛋白（Cucsa.275720）等。其中，還包含有一個(gè)TIR-NBS-LRR蛋白（Cucsa.275630）。

3 討論

MICHELNORE等[24]最早利用群體分離分析法（bulked segregant analysis）在萵苣中篩選到與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，簡(jiǎn)稱(chēng)BSA法。此后，BSA 法與不同類(lèi)型的分子標(biāo)記（RFLP、RAPD、SSR標(biāo)記等）相結(jié)合，廣泛地應(yīng)用于作物重要農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因定位研究中，顯示出巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景[25]。近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，也隨之產(chǎn)生了基于全基因組重測(cè)序的BSA-seq技術(shù)。BSA-seq技術(shù)將基因組測(cè)序技術(shù)與極端性狀個(gè)體 DNA混池有機(jī)結(jié)合，使基因定位克隆又迎來(lái)了一個(gè)新的階段[26]。本研究構(gòu)建了各包含20個(gè)單株的抗、感池，通過(guò)基因組重測(cè)序獲得5 Gb的序列，將候選基因初步定位于黃瓜5號(hào)染色體的15—25 Mb處。

目前，在黃瓜白粉病抗性基因QTL的定位研究上已經(jīng)有大量的報(bào)道，張桂花等[3]利用F2分離群體，通過(guò)構(gòu)建抗感池，獲得一個(gè)AFLP標(biāo)記，與黃瓜的白粉病抗性基因連鎖，遺傳距離為5.56 cM。簡(jiǎn)德明[7]獲得與黃瓜白粉病感病基因連鎖的 AFLP標(biāo)記（P63M51-384）和SCAR標(biāo)記（PMSCAR-300），連鎖距離均為7 cM。此外，還有利用SSR標(biāo)記開(kāi)展抗性基因定位的研究，張海英等[27]獲得 2 個(gè)與黃瓜白粉病主效抗病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記SSR97-200和SSR273-300，連鎖遺傳距離分別為5和13 cM。此外，聶京濤等[28]研究認(rèn)為SSR標(biāo)記SSR15592與黃瓜白粉病基因緊密連鎖，且與抗性基因的遺傳距離為7.62 cM。SSR連鎖標(biāo)記的獲得也使得開(kāi)展黃瓜白粉病分子育種成為可能。同樣，在黃瓜白粉病研究中也有大量關(guān)于QTL定位的研究報(bào)道，例如張圣平等[13]檢測(cè)到1個(gè)白粉病的抗性基因的QTL位點(diǎn)，其中位于5號(hào)染色體的pm5.2位點(diǎn)的效應(yīng)最強(qiáng)。XU等[29]在 1號(hào)染色體上檢測(cè)到1個(gè)白粉病抗性基因QTL位點(diǎn)Pm1.1，位于S6472和SSR16881之間，物理距離為41.1 kb，在該區(qū)段預(yù)測(cè)到8個(gè)候選基因。XU等[30]在5號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了與Pm5.1抗性有關(guān)的8個(gè)候選基因，包括編碼受體蛋白激酶基因、轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白基因等。值得注意的是，多數(shù)白粉病抗性基因定位在5號(hào)染色體。本研究中，PM74基因定位于5號(hào)染色體SSR07531和SSR15321標(biāo)記之間，物理距離為238 444 bp，包含一個(gè)TIR-NBS-LRR Like基因。

圖3 黃瓜白粉病抗性基因精細(xì)定位Fig. 3 Fine mapping of powdery mildew resistance gene in cucumber

表1 候選區(qū)段基因信息Table 1 Gene information in the candidate regions

NBS是一類(lèi)非常重要的抗病基因，在其他作物中有大量報(bào)道的抗性基因?qū)儆贜BS類(lèi)基因，例如小麥抗條銹病基因Yr10（CC-NBS-LRR），小麥抗稈銹病基因Sr33（CC-NBS-LRR），大麥中白粉病基因Mla1（CC-NBS-LRR），亞麻中的銹病基因L6（TIR-NBS-LRR）和M（TIR-NBSLRR）[31-35]。而黃瓜中也有關(guān)于NBS類(lèi)基因的報(bào)道，張圣平在5號(hào)染色體上定位到的白粉病抗性基因候選區(qū)段包含4個(gè)NBS類(lèi)抗病基因[13]，依據(jù)標(biāo)記信息比對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，PM74所在區(qū)段與張圣平等[13]所定位的基因并不在同一個(gè)scaffold，初步認(rèn)定PM74是不同于其所定位的基因。同樣，NIE等[36]定位的基因是位于scaffold000038，與PM74也不在同一個(gè)scaffold。初步認(rèn)為PM74是位于5號(hào)染色體的一個(gè)新的抗性基因，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

在黃瓜‘74’自交系的5號(hào)染色體15—25 Mb處檢測(cè)到一個(gè)貢獻(xiàn)率為41.95%的白粉病抗性基因，初步命名為PM74。該抗性基因位于SSR15321和SSR07531之間，遺傳距離為3.06 cM，物理距離為238 444 bp。該預(yù)測(cè)候選區(qū)段內(nèi)包含有 17個(gè)基因，其中 Cucsa.275630為T(mén)IR-NBS-LRR類(lèi)基因。