尹馨，馬樹杰，李梅，鄧國(guó)華，侯玉杰，崔鵬飛，施建忠，陳化蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

0 引言

【研究意義】禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種嚴(yán)重危害家禽和人類健康的人畜共患病，其基因組是由 8個(gè)單股負(fù)鏈RNA組成，病毒在其復(fù)制過(guò)程中突變、重組頻繁，容易產(chǎn)生威脅動(dòng)物和人類健康的新型流感病毒。低致病性H7N9亞型禽流禽感病毒（注：本文中若不特殊說(shuō)明，低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均指的是對(duì)雞的致病性）自2013年在我國(guó)首次出現(xiàn)以來(lái)，不僅造成我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失，而且已經(jīng)導(dǎo)致大量的人類感染及死亡[1]。2017年初，對(duì)家禽呈現(xiàn)低致病力的H7N9病毒進(jìn)一步發(fā)生變異，在其病毒HA基因裂解位點(diǎn)區(qū)域增加了4個(gè)氨基酸，致使該類型病毒由對(duì)雞只的低致病性突變?yōu)楦咧虏⌒訹2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類的感染源自接觸了H7N9病毒感染的家禽以及被污染的環(huán)境[3-8]。生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，H7N9病毒之所以能夠感染并導(dǎo)致人死亡，與其病毒基因位點(diǎn)的突變以及獲得了一些致病力相關(guān)基因位點(diǎn)有關(guān)[8-12]。因此，開(kāi)展H7N9病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病力研究及其致病機(jī)制研究，將起到預(yù)警和評(píng)估跨物種感染和對(duì)哺乳動(dòng)物的致病能力變化，充實(shí)科學(xué)防控流感的重要科學(xué)依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和公共衛(wèi)生學(xué)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)2013年的H7N9病毒的研究表明，人源H7N9病毒與禽源H7N9病毒高度同源，從家禽中分離的H7N9病毒對(duì)家禽和哺乳動(dòng)物并無(wú)致病力。但H7N9病毒在感染人后，很容易獲得PB2蛋白E627K，D701N的突變，進(jìn)而能夠增強(qiáng)流感病毒在哺乳動(dòng)物上的致病力和傳播能力，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的感染和死亡[10,13-19]。2017年新發(fā)高致病性H7N9病毒在其堿性裂解位點(diǎn)區(qū)域獲得了4個(gè)氨基酸的插入，表現(xiàn)為對(duì)雞的高致病性，但裂解位點(diǎn)區(qū)域氨基酸的增加并不一定影響病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性，試驗(yàn)證明，早期的高致病性H7N9病毒對(duì)哺乳動(dòng)物并無(wú)致病力，但高致病性病毒在獲得PB2蛋白 627K或者701N的突變后，可以獲得比2013年人源病毒更強(qiáng)的致病力，并可在雪貂之間經(jīng)呼吸道飛沫傳播[2,20]。另外，在H5亞型流感病毒的致病力、傳播能力研究中，受體結(jié)合位點(diǎn)以及PB2蛋白627位點(diǎn)的改變或者是與人源流感病毒發(fā)生重組也不同程度的影響流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病力和傳播能力[21-30]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)家禽呈現(xiàn)低致病力的H7N9病毒同樣對(duì)哺乳動(dòng)物模型小鼠不表現(xiàn)任何的致病力[19]。但是，2015年，我們?cè)诤鲜〉碾u樣品中分離到一株低致病性H7N9病毒，A/chicken/Hunan/S40726/2015(H7N9) (簡(jiǎn)稱HuN/S40726)，卻對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠表現(xiàn)為高致病力，其小鼠半數(shù)致死量（MLD50）為3.38 log10EID50/0.1mL。對(duì)比分析其影響病毒致病力的關(guān)鍵分子特征，發(fā)現(xiàn)其PB2蛋白627位點(diǎn)為V，有別于大多數(shù)禽源H7N9病毒627E和人源H7N9病毒627E/K。為了了解該病毒致病力的變化及其分子機(jī)制，我們開(kāi)展了本研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，救獲HuN/S40726重組病毒驗(yàn)證其致病力差異，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，突變病毒PB2 蛋白的627位氨基酸，從而通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 PB2蛋白的 627V是否影響HuN/S40726毒株的致病力，并研究其致病力差異的分子機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.1 病毒株與質(zhì)粒

低致病性H7N9病毒（注：本文中若不特殊說(shuō)明，低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均指的是對(duì)雞的致病性）A/Chicken/Hunan/S40726/2015（H7N9）（簡(jiǎn)稱HuN/S40726），A/chicken/Shanghai/S1053/2013（H7N9）（簡(jiǎn)稱 SH/S1053）由獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。其他用于PB2蛋白627位氨基酸分析比較的H5、H7亞型流感病毒序列均來(lái)自GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)。雙向表達(dá)載體pBD以及真核表達(dá)載體pCAGGS由獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與材料

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自日本TOYOBO公司；EasyTaqDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1購(gòu)自美國(guó)ABI公司；同源重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTM3000）購(gòu)自 Invitrogen 公司；Primer STAR 購(gòu)自TaKaRa公司；雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自Promega；6周齡BALB/c雌性小鼠（14—16 g）購(gòu)自北京維通立華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；所用9—10日齡SPF雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)HuN/S40726和SH/S1053病毒的基因全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì) PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS的8個(gè)基因克隆擴(kuò)增引物和定點(diǎn)突變引物, 以及用于構(gòu)建HuN/S40726和SH/S1053聚合酶復(fù)合表達(dá)質(zhì)粒的克隆引物（表1）。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取 HuN/S40726毒株的病毒 RNA，按照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用高保真酶Primer STAR和克隆引物擴(kuò)增8個(gè)基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Omega膠回收試劑盒純化回收。同樣使用pBD克隆引物擴(kuò)增pBD載體使之線性化，并用DpnI酶處理。利用Vazyme CloneExpress II 重組克隆試劑盒進(jìn)行同源重組反應(yīng)，將病毒的各片段克隆于pBD載體中。以病毒的PB2-pBD質(zhì)粒為模版，按照點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f(shuō)明書進(jìn)行突變反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)中提后用于轉(zhuǎn)染。

1.5 病毒的救獲以及序列鑒定

按照 LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒方法，將病毒的8個(gè)片段的陽(yáng)性重組質(zhì)?；旌?，每個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒500 ng，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后將細(xì)胞液接種9—10日齡雞胚，0.4 mL/枚，37℃培養(yǎng)，48 h后收取尿囊液進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，HA試驗(yàn)陽(yáng)性的尿囊液分裝凍存于-80℃。對(duì)救獲的病毒提取RNA，擴(kuò)增全基因組進(jìn)行測(cè)序，利用 DNAstar軟件比較救獲病毒與原病毒是否相同，以及突變毒株是否實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。

1.6 小鼠感染性試驗(yàn)

救獲的病毒稀釋至 106EID50/50 μL，采用干冰麻醉小鼠，8只小鼠依次鼻腔接種50 μL。感染3d后，隨機(jī)剖殺3只小鼠，取腦、脾、肺、腎、鼻甲通過(guò)雞胚滴定，檢測(cè)病毒在小鼠各臟器內(nèi)的復(fù)制情況。其余5只小鼠，每天觀察其臨床表現(xiàn)，記錄小鼠14 d內(nèi)的體重變化。攻毒后小鼠飼養(yǎng)于IVC鼠籠中，提供優(yōu)質(zhì)充足的飼料和飲水。環(huán)境溫度為21℃左右。

1.7 小鼠半數(shù)致死量（MLD50）的測(cè)定

將病毒稀釋至101—106EID50/50 μL，每個(gè)劑量鼻腔感染5只小鼠。每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)，記錄14 d內(nèi)小鼠的體重變化以及死亡情況。根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒的小鼠半數(shù)致死量（MLD50）。

1.8 聚合酶活性試驗(yàn)

使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)比較聚合酶的活性。構(gòu)建HuN/S40726病毒及其突變病毒的聚合酶復(fù)合表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，以 SH/S1053病毒為背景毒株構(gòu)建聚合酶復(fù)合表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)作為對(duì)照，所用載體為pcDNA3.1載體。按照LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒方法，將構(gòu)建好的病毒的PB2，PB1，PA，NP表達(dá)質(zhì)粒與螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒p-Luci以及內(nèi)參TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，33℃和37℃下培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞，離心收取上清液，熒光素酶的測(cè)定按照熒光素酶試劑盒的推薦步驟進(jìn)行。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 HuN/S40726毒株對(duì)BALB/c小鼠的致病性分析

本研究中，筆者通過(guò)對(duì)比研究低致病性H7N9代表毒株，HuN/S40726和SH/S1053病毒對(duì)哺乳動(dòng)物模型小鼠的致病性，發(fā)現(xiàn)低致病性 H7N9代表株SH/S1053病毒僅能在小鼠的鼻甲和肺臟中低拷貝復(fù)制，且并不致死小鼠，其MLD50為≥6.5 log10EID50/ 0.1 mL（圖1-B）；然而，2015年在湖南分離的HuN/S40726病毒卻可以在小鼠的鼻甲和肺臟高效復(fù)制，并可以跨越血腦屏障，在小鼠的腦中復(fù)制，其 MLD50為 3.38 log10EID50/0.1 mL（圖1-A），呈現(xiàn)與SH/S1053病毒臟器復(fù)制能力的極顯著差異。

2.2 可能導(dǎo)致HuN/S40726病毒發(fā)生致病力變化的相關(guān)基因位點(diǎn)對(duì)比分析

在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)家禽呈現(xiàn)低致病力的H7N9病毒同樣對(duì)哺乳動(dòng)物模型小鼠不表現(xiàn)任何的致病力[19]。通過(guò)分析上述兩個(gè)代表株致病能力差異的結(jié)果，我們認(rèn)為HuN/S40726毒株呈現(xiàn)對(duì)小鼠的高致病力，有可能與其病毒基因發(fā)生了突變或者獲得了一些致病力相關(guān)基因位點(diǎn)有關(guān)。因此，我們對(duì)兩株代表毒株進(jìn)行了可能導(dǎo)致毒株發(fā)生致病力變化的相關(guān)基因位點(diǎn)對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株病毒僅在PB2蛋白627位氨基酸存在差異，HuN/S40726毒株為PB2/627V、SH/S1053毒株為PB2/627E（表2）

圖1 HuN/S40726毒株對(duì)BALB/c小鼠的致病力Fig. 1 Virulence of HuN/S40726 in BALB/c mice

2.3 PB2蛋白627位氨基酸分析

為確認(rèn)PB2蛋白627V是否在自然界其他病毒中存在并是否大量存在，下載 GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中2013—2018年的H5、H7N9病毒的PB2基因序列，通過(guò)分析PB2蛋白627位氨基酸發(fā)現(xiàn)，PB2蛋白的627位氨基酸相對(duì)保守，幾乎所有禽源H5、H7N9病毒此位點(diǎn)為E；在1 148株人源H7N9病毒中，826株病毒為627K，288株病毒為627E，另外34株病毒存在627V（表 3）。上述結(jié)果顯示，自然界一直以來(lái)同時(shí)存在著627E/K/V 3種變體，更有可能代表著不同的致病力特征。

2.4 救獲病毒以及定點(diǎn)突變病毒對(duì)BALB/c小鼠的致病性

為了了解是否 PB2蛋白 E627V的改變導(dǎo)致HuN/S40726病毒的致病力變化，我們通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)、點(diǎn)突變技術(shù)，分別救獲 rHuN/S40726重組毒以及兩株單點(diǎn)氨基酸突變病毒，rHuN/S40726-PB2/627E、rHuN/S40726-PB2/627K。以106EID50/ 0.05ML感染小鼠，結(jié)果顯示，rHuN/S40726-PB2/627K點(diǎn)突變病毒能在小鼠的鼻甲和肺臟中高效復(fù)制，在腦中低拷貝復(fù)制，MLD50為4.5 log10EID50，與以往的研究報(bào)道中PB2/627K能夠增強(qiáng)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病力結(jié)果相一致[13-19]；rHuN/S40726重組病毒與HuN/S40726野生毒株對(duì)小鼠的致病力一致，均能致死小鼠，MLD50分別為 3.5 log10EID50和3.38 log10EID50，說(shuō)明rHuN/S40726重組病毒對(duì)小鼠一樣呈現(xiàn)對(duì)小鼠的高致病性特征；rHuN/S40726重組病毒點(diǎn)突變株rHuN/S40726-PB2/627E僅在小鼠的鼻甲和肺臟中復(fù)制，不能在小鼠的腦內(nèi)復(fù)制，也不能造成小鼠的死亡，其 MLD50大于 6.5 log10EID50，相比rHuN/S40726重組毒致病力降低了至少1 000倍（詳見(jiàn)圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明，PB2蛋白V627E的突變可以明顯降低HuN/S40726病毒對(duì)小鼠的致病力。

表2 代表毒株致病力相關(guān)基因位點(diǎn)對(duì)比分析Table 2 Comparative analysis of the genetic site in the pathogenic factors of the H7N9 strain

表3 自然界中H5、H7N9病毒PB2蛋白627位點(diǎn)氨基酸分析Table 3 Analysis of PB2 protein 627 Aa site in H5 and H7N9 viruses in nature

2.5 聚合酶活性檢測(cè)

PB2蛋白627位氨基酸的改變，一般會(huì)影響病毒聚合酶活性，本研究中筆者推測(cè)HuN/S40726病毒PB2蛋白E627V改變影響了病毒聚合酶活性，進(jìn)而改變了病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性。為進(jìn)一步揭示HuN/S40726病毒PB2蛋白627V影響病毒對(duì)小鼠致病力的內(nèi)在機(jī)制，構(gòu)建了HuN/S40726病毒PB1、PA、NP基因以及PB2的3種突變基因表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)在細(xì)胞上表達(dá)聚合酶來(lái)分析PB2蛋白627位氨基酸的突變對(duì)聚合酶活性的影響。結(jié)果顯示，不論是在33℃還是37℃下，與 PB2/627E共表達(dá)質(zhì)粒組合相比，PB2/627V，PB2/627K組合均能提高病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的聚合酶活性，與病毒的致病性呈正相關(guān)（圖 3-A）。同樣的，以SH/S1053病毒為背景，PB2/627V、PB2/627K組合也均能提高H7N9病毒的聚合酶活性（圖3-B），遠(yuǎn)高于PB2/627E共表達(dá)質(zhì)粒組合的聚合酶表達(dá)活性。

3 討論

自2013年中國(guó)上海市出現(xiàn)全球首例人感染H7N9病毒并死亡病例以來(lái)，H7N9病毒一直在威脅著人類的健康。截止2018年3月2日，H7N9病毒已有全球范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)室確診病例1 567例，包括死亡病例615例（http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/HAI_Risk_Assessment/en/）。而經(jīng)過(guò)4年來(lái)病毒在家禽中的不斷傳播、遺傳進(jìn)化，2017年初，低致病性的H7N9病毒在其裂解位點(diǎn)區(qū)域增加了4個(gè)氨基酸的插入（-KRTA-），使得該類型病毒突變成了高致病性H7N9病毒，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)以巨大的打擊。

流感病毒是一種單股負(fù)鏈 RNA病毒，頻繁的變異是它的天性。將低致病性流感病毒突變?yōu)楦咧虏⌒粤鞲胁《臼亲畈幌ＭO(jiān)測(cè)到的突變，使得一種新型流感病毒可以在人類中飛沫傳播。在本研究中，筆者通過(guò)常規(guī)監(jiān)測(cè)在1株低致病性H7N9病毒中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)令人擔(dān)憂的PB2 E627V突變，這種突變使得對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠的致病力增加1 000倍以上，彰顯了單個(gè)基因位點(diǎn)改變病毒致病力特性的巨大作用。而一旦該類病毒在家禽中得以傳播開(kāi)來(lái)，對(duì)人的致病性風(fēng)險(xiǎn)將增加很大。該發(fā)現(xiàn)為防控H7N9提供了科學(xué)依據(jù)。

以往研究數(shù)據(jù)顯示，病毒的單個(gè)基因/關(guān)鍵性位點(diǎn)或多個(gè)基因/關(guān)鍵性位點(diǎn)往往決定著流感病毒致病力和傳播能力的變化[11]。在H5、H7N9流感病毒研究中，有關(guān)PB2蛋白627位氨基酸的改變，均顯示影響著病毒對(duì)宿主的致病力變化和是否能夠在宿主間具有傳播能力[13-20]。PB2蛋白627K（絕大多數(shù)人源流感病毒存在此氨基酸）是禽流感病毒能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效復(fù)制的關(guān)鍵影響位點(diǎn)。相反的，基本上全部的禽源病毒具有PB2 627 E（絕大多數(shù)禽源流感病毒存在此氨基酸）也因?yàn)樵撐稽c(diǎn)限制了禽源病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力[16,19]。最近的一項(xiàng)研究表明，流感病毒PB2蛋白 627位點(diǎn)的突變與宿主體內(nèi)的 ANP32A蛋白有關(guān)，ANP32A充當(dāng)“內(nèi)鬼”，輔助病毒進(jìn)入細(xì)胞后復(fù)制活動(dòng)，而禽流感無(wú)法利用哺乳動(dòng)物的ANP32A蛋白，除非病毒發(fā)生 PB2蛋白 E627K的突變[31]。我們之前報(bào)道過(guò)低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均對(duì)小鼠無(wú)致病力，而當(dāng)病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得PB2蛋白E627K，D701N等突變后，H7N9病毒對(duì)小鼠、雪貂的致病力可以顯著的提高甚至致死小鼠和雪貂，并可在雪貂之間經(jīng)呼吸道飛沫傳播[2,19]。本研究中，筆者在2015年對(duì)湖南省開(kāi)展動(dòng)物流感病毒監(jiān)測(cè)中，分離到 1株對(duì)小鼠表現(xiàn)為高致病力的 H7N9病毒（HuN/S40726），對(duì)其致病力、傳播能力等關(guān)鍵性的分子特征進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)其PB2蛋白627位氨基酸為V，其有別于禽源H7N9病毒特征的PB2蛋白627E和人源H7N9病毒特征的PB2蛋白627K。是否該病毒PB2蛋白627V使得HuN/S40726病毒對(duì)小鼠呈高致病性。通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)，救獲了 HuN/S40726重組毒以及對(duì)其 PB2 627位氨基酸突變的重組毒株rHuN/S40726-PB2/627E、rHuN/S40726-PB2/627K。通過(guò)小鼠致病性評(píng)估試驗(yàn)，PB2蛋白E627V的改變顯著的增強(qiáng)了HuN/S40726病毒對(duì)小鼠的致病力，使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50變化為3.5 log10EID50，病毒毒力增強(qiáng)了1 000倍以上。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，HuN/S40726病毒通過(guò)顯著提高HuN/S40726病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的聚合酶活性，改變了該病毒對(duì)小鼠的致病性。綜上所述，PB2蛋白的 627V是HuN/S40726病毒對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠表現(xiàn)高致病力的重要分子基礎(chǔ)。

圖2 救獲病毒對(duì)BALB/c小鼠的致病力Fig. 2 Virulence of rescued viruses in BALB/c mice

圖3 H7N9禽流感病毒的聚合酶活性Fig. 3 Polymerase activity of H7N9 avian influenza virus

分析GISAID數(shù)據(jù)系統(tǒng)下載的2013-2018年的人源H7N9病毒序列，我們發(fā)現(xiàn)人源H7N9病毒中已經(jīng)存在部分的病毒具有 PB2蛋白 627V，而禽源 H7N9病毒中并未發(fā)現(xiàn)具有PB2蛋白627V的毒株，顯示該類型對(duì)人的感染同樣存在大的風(fēng)險(xiǎn)性。因此，對(duì)于H7N9病毒還應(yīng)采取不間斷的流行病學(xué)調(diào)查工作，密切關(guān)注其遺傳進(jìn)化以及生物學(xué)特性的變化。

4 結(jié)論

PB2蛋白627位氨基酸（V）決定了HuN/S40726病毒對(duì)小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改變能夠顯著增強(qiáng)HuN/S40726病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的聚合酶活性，是引起HuN/S40726病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病力的重要因素。