楊勁松，吳濤，李金祥

（1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081）

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI），是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，可導(dǎo)致家禽、各種野鳥、特別是遷徙水禽的感染，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報告的動物疫病[1]，我國將其列為一類動物疫病。1878年首次報道禽流感病毒（AIV）在意大利雞群中暴發(fā)[2]，隨后世界各地均有該病暴發(fā)和流行的報道，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。l997年發(fā)生在我國香港的禽流感感染人事件，更加引起人們對該病的關(guān)注。2005年，H5N1亞型禽流感病毒引起野生鳥類的大規(guī)模死亡，并隨野生鳥類的遷徙而傳播到更廣泛的區(qū)域[3]。十余年來，我國發(fā)現(xiàn)的H5亞型禽流感病毒多為H5N1亞型。但是近些年來，在我國H5N2、H5N8、H5N6、H5N5 等亞型顯著增多[4-6]。

高致病性禽流感在我國暴發(fā)后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部采取免疫與撲殺相結(jié)合的防控措施,其中全面免疫是關(guān)鍵技術(shù)措施和突出特點[7]，因此在較短時間內(nèi)就控制了禽流感疫情[8]。國家規(guī)定每年春秋兩季進行集中強制免疫，使用的疫苗主要為重組禽流感病毒滅活疫苗。對于疫苗質(zhì)量，國家高度重視，并對疫苗生產(chǎn)企業(yè)采取了嚴(yán)格的監(jiān)管措施和市場準(zhǔn)入制度，為禽流感的防控發(fā)揮了重要作用[9]。為了促進疫苗生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)進步，保障疫苗質(zhì)量，對近年來重組禽流感滅活疫苗的質(zhì)量情況進行了分析，并提出了禽流感疫苗的研制發(fā)展方向，以期為禽流感疫苗的生產(chǎn)和研制提供有益的幫助。

1 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的種類和使用情況

2004年初我國首次批準(zhǔn)使用了低致病性 H5N2亞型的禽流感病毒滅活疫苗（N28株），但由于H5N2亞型禽流感病毒的復(fù)制效率低，與國內(nèi)流行株抗原匹配性差。2005年1月，又推出了針對第0分支的Re-1株疫苗。隨著病毒抗原性的不斷變異[10-11]，原有疫苗的保護效率下降，不足以對新出現(xiàn)的病毒或變異株提供足夠的保護[12]。2007年至2008年3月，先后推出針對第7分支的 Re-4株疫苗和第2.3.4分支病毒的Re-5株疫苗[13]。2010年開始，第2.3.4分支的病毒開始出現(xiàn)較大變異[14-16]，導(dǎo)致Re-5株疫苗對其保護效果較差。2012年3月，我國推出了針對第2.3.2.1分支Re-6株疫苗[17]，替換原來的 Re-5株疫苗。2014 年4月，推出針對第7.2分支[18]的Re-7株疫苗，替換原來的 Re-4株疫苗，2016年至今我國未再分離到7.2分支病毒。2013年以來，多地暴發(fā)了由2.3.4新分支病毒引起的高致病性禽流感疫情，國際H5N1進化工作組將該變異株分支命名為第2.3.4.4分支[19]。2015年 11月，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了針對該分支病毒的 Re-8株疫苗，并于2016 年2月開始上市使用。目前，對于禽流感H5亞型病毒來說，2.3.4.4分支是在我國流行的主要分支，另有少量的新型 2.3.2.1分支病毒和野鳥型病毒。到目前為止，高致病性禽流感H5N1毒株共劃分出 10 個進化支（0—9）[20]。禽流感 Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8 各疫苗株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在 0.17—0.67 之間，表明不同分支之間的抗原性有較大差異[21]，因此必須使用匹配相應(yīng)分支的疫苗才能取得理想的防控效果。

2 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的生產(chǎn)現(xiàn)狀

目前國內(nèi)生產(chǎn)重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗的生產(chǎn)企業(yè)共有10家，分別是哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司、青島易邦生物工程有限公司、肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司、乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠、遼寧益康生物股份有限公司、廣東永順生物制藥股份有限公司、哈藥集團生物疫苗有限公司、南京梅里亞動物保健有限公司、吉林冠界生物技術(shù)有限公司、山東信得動物疫苗有限公司。其中吉林冠界生物技術(shù)有限公司和山東信得動物疫苗有限公司采用懸浮細(xì)胞工藝生產(chǎn)，其余8個廠家均采用雞胚工藝進行疫苗生產(chǎn)。

國內(nèi)近三年來取得生產(chǎn)批準(zhǔn)文號并已投入生產(chǎn)的重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗主要有：重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗（Re-6株）、重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株）、重組禽流感病毒 H5亞型二價滅活疫苗（Re-6株+Re-8株）、重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5亞型）二價滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5亞型）三價滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）。根據(jù)禽流感病毒的流行趨勢，2016年 4月至 2017年7月農(nóng)業(yè)部規(guī)定將重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）作為主要的高致病性禽流感強制免疫疫苗[22]；2017年7月至今，農(nóng)業(yè)部規(guī)定將重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）作為主要的高致病性禽流感強制免疫疫苗[23]。

近三年重組禽流感病毒滅活疫苗的批簽發(fā)批數(shù)和總產(chǎn)量均呈明顯上升趨勢，2017年的總產(chǎn)量較 2015年增長了26.2%（表1）。

表1 2015—2017年重組禽流感病毒滅活疫苗產(chǎn)量統(tǒng)計Table 1 Production statistics of recombinant avian influenza virus inactivated vaccine from 2015 to 2017

3 我國對重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的質(zhì)量監(jiān)管

重組禽流感病毒滅活疫苗的質(zhì)量監(jiān)管由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局主管，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所負(fù)責(zé)具體實施。為進一步加強疫苗質(zhì)量監(jiān)管，把對農(nóng)業(yè)部定點生產(chǎn)企業(yè)進行獸藥 GMP監(jiān)督檢查、實施產(chǎn)品的監(jiān)督抽檢和落實批簽發(fā)制度作為三大有效的監(jiān)管手段。此外，針對投訴、舉報等情況，還要組織不定期的獸藥 GMP飛行檢查。

3.1 企業(yè)監(jiān)督檢查

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所每年組織春秋兩季監(jiān)督檢查，實現(xiàn)對重組禽流感病毒滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)每年兩次全覆蓋檢查。檢查重點包括企業(yè)生產(chǎn)情況、GMP有效管理情況、疫苗生產(chǎn)和檢驗過程中的質(zhì)量控制情況、生物安全管理情況等。2015年檢查18家次，2016年檢查18家次，2017年檢查20家次。

3.2 產(chǎn)品監(jiān)督抽檢

不僅從企業(yè)成品庫抽檢，而且從產(chǎn)品流通、使用環(huán)節(jié)著手，加強對政府招標(biāo)采購重大動物疫病疫苗的監(jiān)管，并且逐年增加流通、使用環(huán)節(jié)的抽檢數(shù)量。近三年共監(jiān)督抽檢重組禽流感H5亞型滅活疫苗130批次，合格率均為100%。

3.3 成品批簽發(fā)制度

每批獸用生物制品在出廠前須經(jīng)監(jiān)管部門審查批準(zhǔn)后，產(chǎn)品方可上市銷售。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所調(diào)整了批簽發(fā)環(huán)節(jié)工作方式，提高產(chǎn)品批簽發(fā)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，將獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)改為企業(yè)成品的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對提高產(chǎn)品質(zhì)量取得了較好效果。2015年重組禽流感病毒滅活疫苗批簽發(fā)批數(shù)為1 507批，2016年為1 715批，2017年為1 856批，簽發(fā)率均為100%。由此看出重組禽流感病毒滅活疫苗的批簽發(fā)批數(shù)呈明顯上升趨勢，2017年的批簽發(fā)批數(shù)較 2015年增長了23.2%。

4 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的質(zhì)量分析

作為合格疫苗的評價標(biāo)準(zhǔn)，一定要做到安全、有效和質(zhì)量可控。筆者根據(jù)企業(yè)上報的批簽發(fā)報告情況，以2016年至2017年農(nóng)業(yè)部規(guī)定的高致病性禽流感強制免疫疫苗重組禽流感病毒 H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）為例，進行數(shù)據(jù)分析。隨機選取了4家疫苗生產(chǎn)企業(yè)，分別為3家雞胚生產(chǎn)工藝（簡稱為企業(yè)1、企業(yè)2、企業(yè)3）和1家懸浮細(xì)胞生產(chǎn)工藝（簡稱為企業(yè) 4），從疫苗的安全性和效力兩方面對重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗進行質(zhì)量分析，為疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供改進生產(chǎn)工藝、提升疫苗質(zhì)量的建議。

4.1 疫苗的安全性分析

對4家企業(yè)在2016至2017年生產(chǎn)的488批次疫苗安全檢驗統(tǒng)計結(jié)果顯示，所有批次均符合規(guī)定。這與現(xiàn)地反饋重組禽流感病毒滅活疫苗在免疫后一般無可見不良反應(yīng)的說法相一致，但在局部地區(qū)偶有發(fā)生蛋雞免疫后產(chǎn)蛋率下降的現(xiàn)象。經(jīng)分析，造成此現(xiàn)象有兩個方面原因。一是免疫過程對蛋雞的應(yīng)激會造成短時間的產(chǎn)蛋率下降，但此影響過程是短暫的。有報道指出，處于產(chǎn)蛋期的蛋雞對應(yīng)激因素敏感，對外界任何刺激都會表現(xiàn)出一定的應(yīng)激反應(yīng)，在接種后產(chǎn)蛋率一般都會出現(xiàn) 2—3周的下降[24]。因此，為了減少這種情況的發(fā)生，在產(chǎn)蛋高峰期接種的雞群，可以在接種免疫前后各3 d，在飲水后飼料中添加電解多維、維生素C等抗應(yīng)激劑，緩解和降低各種應(yīng)激反應(yīng)。同時，將疫苗恢復(fù)至室溫，在傍晚注射也可降低應(yīng)激反應(yīng)。從疫苗本身講，不排除疫苗中雜蛋白含量較高或甲醛、內(nèi)毒素含量較高而引起的疫苗免疫副反應(yīng)，可通過抗原純化和降低內(nèi)毒素含量等措施來減少疫苗副反應(yīng)的發(fā)生。

4.2 疫苗的效力分析

對4家企業(yè)的488批次重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）的效力檢驗數(shù)據(jù)情況進行分析，其中2016年生產(chǎn)327批，2017年生產(chǎn)161批。檢測方法均為血清學(xué)方法。

4.2.1 Re-6株、Re-7株、Re-8株不同組分效價的比較 435批雞胚生產(chǎn)工藝疫苗Re-6株組分抗體效價的幾何平均滴度（GMT）為8.7 log2；Re-7株組分抗體效價 GMT為 7.4 log2；Re-8株組分抗體效價GMT為8.7 log2。53批懸浮培養(yǎng)工藝疫苗Re-6株組分抗體效價GMT為8.3 log2；Re-7株組分抗體效價GMT為8.1 log2；Re-8株組分抗體效價GMT為8.2 log2。由此可以看出，所有批次疫苗抗體效價GMT至少高于國家標(biāo)準(zhǔn)（6 log2）1個滴度以上，而Re-6株和Re-8株組分抗體效價GMT至少高于國家標(biāo)準(zhǔn)2個滴度以上。對于雞胚生產(chǎn)工藝疫苗而言，Re-6株和Re-8株組分抗體效價GMT基本一致，均高于Re-7株組分1個滴度以上，在生產(chǎn)工藝規(guī)程要求抗原配比為 1∶2∶1的情況下，說明 Re-6株和 Re-8株病毒的雞胚適應(yīng)性明顯優(yōu)于 Re-7株。而懸浮培養(yǎng)工藝疫苗的3個組分，抗原按生產(chǎn)工藝規(guī)程要求配比為1∶2∶1的情況下，抗體效價的幾何平均滴度基本一致，說明 Re-7株的細(xì)胞適應(yīng)性優(yōu)于雞胚適應(yīng)性。雞胚生產(chǎn)工藝疫苗3個組分中有2個組分抗體效價GMT高于懸浮培養(yǎng)工藝疫苗近0.5個滴度，加之生產(chǎn)工藝技術(shù)環(huán)節(jié)較懸浮培養(yǎng)工藝操作簡單，因此是市場占有量遠(yuǎn)高于懸浮培養(yǎng)工藝疫苗的主要原因。

4.2.2 不同生產(chǎn)年份疫苗效價的比較 4家企業(yè)2016年共生產(chǎn)三價疫苗 327批，2017年共生產(chǎn) 161批。從不同組分抗體效價 GMT（圖 1）可以看出，4個企業(yè)2017年生產(chǎn)疫苗的各組分抗體效價GMT均比2016年有所提高，說明生產(chǎn)工藝的不斷成熟和優(yōu)化，企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量的進一步嚴(yán)格把關(guān)。

4.2.3 不同生產(chǎn)企業(yè)間疫苗效價的比較 從 4家企業(yè)2016至2017年生產(chǎn)疫苗的不同組分抗體效價GMT（圖 2）可以看出，產(chǎn)品的效價雖然都超過了國家標(biāo)準(zhǔn)，但質(zhì)量水平還是參差不齊的，水平較高企業(yè)產(chǎn)品3個組分抗體效價的幾何平均滴度比較低者要高出1.5個滴度以上。

4.2.4 同一疫苗生產(chǎn)企業(yè)不同批次疫苗批間差異的情況 從4家企業(yè)2016至2017年生產(chǎn)疫苗的3個組分抗體效價GMT的最高值和最低值（圖3）可以看出各生產(chǎn)企業(yè)批間差異還是比較大，這雖有生產(chǎn)工藝不斷成熟和優(yōu)化的因素，但相近批次批間差異也會出現(xiàn)較大差異，說明了企業(yè)生產(chǎn)工藝并不十分穩(wěn)定。究其原因，作為雞胚工藝疫苗的重要生產(chǎn)原料低免胚（或非免胚）的質(zhì)量批間差異較大；細(xì)胞工藝疫苗細(xì)胞的培養(yǎng)水平不穩(wěn)定，呈現(xiàn)出同一批次產(chǎn)品 3個組分滴度水平較一致，但整體出現(xiàn)高低起伏的特點，可以用“一損俱損，一榮俱榮”來形容。

圖1 不同生產(chǎn)年份不同組分疫苗抗體效價的比較Fig. 1 Antibody titer comparison of different components in different production year

5 我國禽流感病毒滅活疫苗生產(chǎn)工藝的改進及發(fā)展方向

5.1 生產(chǎn)工藝改進方向 好疫苗的評價標(biāo)準(zhǔn)，一定要安全性高、免疫效果好、副反應(yīng)很小或無副反應(yīng)。現(xiàn)有禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗的安全性高，對同分支的禽流感流行毒株免疫效果好。滅活疫苗中含有的甲醛和細(xì)菌內(nèi)毒素是造成疫苗副反應(yīng)的直接原因，因此改進生產(chǎn)工藝，降低疫苗中甲醛和細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，可以降低疫苗的副反應(yīng)。

圖2 不同生產(chǎn)企業(yè)間疫苗效價的比較Fig. 2 Comparison of vaccine antibody titer from different manufacturers

圖3 同一疫苗生產(chǎn)企業(yè)不同批次疫苗抗體效價批間差異的情況Fig. 3 Difference of antibody titer between different batch vaccines in the same manufacturer

5.1.1 離心純化工藝 通過連續(xù)離心后過濾的方式去除收獲尿囊液中的雜質(zhì)（如蛋殼、卵黃液等）、雜蛋白以及降低污染細(xì)菌的數(shù)量。這樣既可有效的降低滅活時甲醛的使用量，又可以降低細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。

5.1.2 濃縮純化工藝 通過超濾濃縮設(shè)備及配套膜包進行抗原液的濃縮和甲醛的洗脫，可有效提高抗原含量和降低抗原液中的甲醛含量。

5.1.3 滅活劑的選擇 甲醛是最傳統(tǒng)的、應(yīng)用最廣泛的滅活劑，但也存在刺激性強、致癌危險、降低免疫原性、滅活效果受多種因素影響等缺陷。β-丙內(nèi)酯（BPL）對病毒具有很強的滅活作用[25]，而且能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，接種反應(yīng)也輕微。但與甲醛相比，BPL對細(xì)菌的滅活效果不理想且價格昂貴。鹽酸聚六亞甲基胍（PHMG），具有使用濃度低、作用速度快，性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水的特點，常溫下使用具有廣譜高效、長期抑菌作用、毒性低和使用安全等優(yōu)點，但 PHMG價格較貴，不易推廣應(yīng)用。二乙烯亞胺（BEI），具有不損傷病毒的抗原性和免疫原性的優(yōu)點[26]，但對細(xì)菌的殺滅作用較弱且有誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型病毒株可能。BEI現(xiàn)已成功地用于疫苗的生產(chǎn)，特別是由于其保存、毒性及成本等方面的優(yōu)勢而被廣泛采用[27]。有研究表明，BEI在滅活流感病毒感染性的同時，能較好地保持病毒的抗原性[28]，并可減少疫苗的毒副作用，是開發(fā)研制禽流感病毒滅活疫苗的新型滅活劑。

5.2 禽流感疫苗的發(fā)展方向

就目前所研制的禽流感疫苗來看，雞胚生產(chǎn)工藝的全病毒滅活疫苗占據(jù)主流市場。主要原因是雞胚生產(chǎn)工藝繁殖病毒的含量高，對同分支的禽流感流行毒免疫效果良好，生產(chǎn)工藝技術(shù)相對簡單，免疫持續(xù)時間較長等特點。但雞胚作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，存在受雞胚來源、質(zhì)量及自身不穩(wěn)定性的影響，造成疫苗批間質(zhì)量差異顯著以及大規(guī)模生產(chǎn)時暴露性接種和收獲增加了生物安全風(fēng)險。而且由于雞胚的大小不一，限制了自動化接種、收獲，生產(chǎn)效率無法大幅度提高；雞胚中雜蛋白還可能引起過敏反應(yīng)。另外，大批量雞胚的廢棄雞胚的處理也給企業(yè)及環(huán)境帶來了沉重負(fù)擔(dān)。

采用懸浮細(xì)胞工藝可進行大規(guī)模生產(chǎn)，縮短了生產(chǎn)周期，具有自動化控制程度高、批間差異相對較小和產(chǎn)品均一性程度高等優(yōu)點。但目前免疫效果并不優(yōu)于雞胚工藝疫苗，而且由于疫苗中或多或少含有細(xì)胞碎片的原因，有可能帶來一些副反應(yīng)，這也是其沒有能夠占據(jù)主流市場的原因。如何進一步提高禽流感病毒在懸浮細(xì)胞的繁殖滴度，優(yōu)化和提升生產(chǎn)工藝，是懸浮細(xì)胞工藝研究的發(fā)展方向。

目前研究的疫苗還有重組活載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、通用疫苗等。其中，重組活載體疫苗克服了滅活苗所存在的一些問題，可同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[29]，但有母源抗體的家禽接種后效果并不理想且接種后不易通過監(jiān)測抗體水平確認(rèn)免疫效果。亞單位疫苗制作成本過高，免疫期短，不適于用作生產(chǎn)用疫苗，只能作為一種實驗室研究手段。核酸疫苗是當(dāng)前禽流感疫苗研究的前沿技術(shù)，其抗原合成和提呈過程與病原的自然感染相似，可同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，具有其他疫苗所不具備的優(yōu)點，是現(xiàn)階段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗，也是禽流感疫苗研究的一大熱點。

在防控禽流感的過程中，最大的難題來自抗原漂移。由于頻繁的抗原漂移，使得常規(guī)疫苗常常需要不斷更新毒株才能維持保護力，這給實際生產(chǎn)帶來很多不便。具有交叉保護性的廣譜免疫原性的通用疫苗可以有效的解決這一難題[30]，是現(xiàn)階段流感疫苗研究的一個重要研究方向。