韋麗華

【摘要】目的：探討動(dòng)脈粥樣硬化病人血同型半胱氨酸水平與Smad7基因甲基化的關(guān)系。方法：選取我校附院經(jīng)頸動(dòng)脈彩超確診的45名動(dòng)脈粥樣硬化患者及26名健康對(duì)照，采集血液樣本進(jìn)行同型半胱氨酸濃度測(cè)定及用Sequenom甲基化檢測(cè)法檢測(cè)Smad7基因甲基化水平。結(jié)果：與健康對(duì)照組相比，動(dòng)脈粥樣硬化病人的血清同型半胱氨酸濃度明顯升高，同時(shí)，Smad7基因甲基化程度亦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論：同型半胱氨酸可能通過(guò)誘導(dǎo)Smad7基因啟動(dòng)子的高甲基化促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。Smad7基因甲基化為防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的作用靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】動(dòng)脈粥樣硬化；同型半胱氨酸；Smad7；Sequenom甲基化檢測(cè)法

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是嚴(yán)重威害人體健康的常見(jiàn)病。AS的發(fā)病受許多危險(xiǎn)因素影響，大量的流行病學(xué)資料表明，血同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平的升高是其中的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Hcy可通過(guò)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、干擾甲基化反應(yīng)等促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[1]。據(jù)研究報(bào)道，Smad7可以抑制炎癥纖維化反應(yīng)，但其在A(yíng)S中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。由于Smad7基因啟動(dòng)子區(qū)可受甲基化調(diào)控[2]，本研究探討AS病人血中Hcy水平與Smad7基因甲基化的關(guān)系，為AS的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本采集

由固定專(zhuān)人采用彩色超聲血流儀行兩側(cè)頸動(dòng)脈檢查以確定研究對(duì)象。分別檢查雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈起始處、頸動(dòng)脈分叉部、頸總動(dòng)脈。檢查內(nèi)容包括：頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）及有無(wú)斑塊形成。內(nèi)膜中層厚度<1.0mm為內(nèi)膜中層厚度正常，以?xún)?nèi)膜局限性突出管腔，內(nèi)膜厚度≥1.1mm為斑塊形成指標(biāo)。疾病組病人來(lái)自2015年9月至2016年10月廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸血管內(nèi)科經(jīng)頸動(dòng)脈彩超證實(shí)有AS病變的45名患者（男33例，女12例，平均68.2歲），這些患者排除了腫瘤、結(jié)締組織病及內(nèi)分泌代謝紊亂癥；對(duì)照組為經(jīng)該院體檢科檢查體檢報(bào)告正常，且經(jīng)頸動(dòng)脈彩超檢查無(wú)IMT增厚及無(wú)AS斑塊形成的26名健康人（男19例，女7例，平均67.2歲）。疾病組和對(duì)照組在年齡、性別構(gòu)成上相當(dāng)。抽取AS病人和健康對(duì)照者清晨空腹肘靜脈血，全血-80℃冰箱保存?zhèn)溆糜谔崛』蚪MDNA，血清用于Hcy濃度測(cè)定。

1.2 Hcy濃度測(cè)定

按照Hcy檢測(cè)試劑盒（邁克，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)，用循環(huán)酶法檢測(cè)AS病人和健康對(duì)照者血清Hcy濃度。

1.3 基因組DNA提取與亞硫酸氫鹽修飾

按照試劑盒（天根，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)，從AS病人和健康對(duì)照者外周血提取基因組DNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。按照試劑盒（QIAGEN，瑞士）說(shuō)明書(shū)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。

1.4 Sequenom甲基化檢測(cè)

用EpiDesigner軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物覆蓋富含CpG位點(diǎn)的Smad7基因啟動(dòng)子區(qū)。如圖1所示，擴(kuò)增區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，從-619到-196。正向引物序列為5-aggaagagagTGGTAGAAGAAAAGGAGAGGAAGAT-3'，反向引物序列為5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAACCTCTTTCCCCCTTACTAAAC-3。經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下：變性94℃ 4分鐘，（94℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒）循環(huán)45次，最后72℃延長(zhǎng)3分鐘。之后進(jìn)行SAP酶消化處理和酶切反應(yīng)，樹(shù)脂純化后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組間比較采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy測(cè)定結(jié)果

與健康對(duì)照者相比，AS病人的血清Hcy濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖2）。

2.2 Sequenom甲基化檢測(cè)結(jié)果

選取Smad7基因啟動(dòng)子區(qū)第5，8，15，16CpG位點(diǎn)的CpG比值的平均值來(lái)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，AS病人的甲基化程度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖3）。

3 討論

AS的致病機(jī)制包括細(xì)胞外基質(zhì)堆積、炎癥反應(yīng)及DNA甲基化紊亂。Hcy，一種含硫氨基酸，是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的正常代謝產(chǎn)物，是能量代謝及許多需甲基化反應(yīng)的重要的中間產(chǎn)物。正常狀態(tài)下，血漿Hcy濃度為5～15μmol/L，超出此范圍即為高Hcy血癥。DNA甲基化是表觀(guān)遺傳修飾的一種。隨著近年來(lái)對(duì)表觀(guān)遺傳學(xué)的深入研究，Hcy對(duì)心血管疾病發(fā)病的表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控受到越來(lái)越多的關(guān)注。DNA的甲基化在Hcy致AS發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。在A(yíng)S病損部位，呈現(xiàn)整個(gè)基因組低甲基化和部分特異基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化?；蚋呒谆?，低表達(dá)。Smad7可以抑制炎癥纖維化反應(yīng)，在許多疾病中發(fā)揮重要作用[3，4]，但其在A(yíng)S中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。近期研究報(bào)道，Smad7基因啟動(dòng)子區(qū)可受甲基化調(diào)控，在大鼠的肝纖維化病變中，Smad7高甲基化低表達(dá)[2]。本研究分析的Smad7啟動(dòng)子區(qū)包含一個(gè)CpG島（16個(gè)CpG位點(diǎn)），覆蓋TATA-box和GC-box，與基因轉(zhuǎn)錄密切相連。所采用的Sequenom甲基化檢測(cè)法能夠特異性地定量分析多個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平，準(zhǔn)確高效。由結(jié)果得知，隨著AS病人血清Hcy濃度的升高，其Smad7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平也明顯升高。因?yàn)楦呒谆绊懟虻霓D(zhuǎn)錄，據(jù)此推測(cè)Smad7低表達(dá)從而促進(jìn)AS的炎癥纖維化病變。

綜上所述，Hcy可能通過(guò)誘導(dǎo)Smad7基因啟動(dòng)子的高甲基化促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。檢測(cè)Smad7啟動(dòng)子甲基化水平可輔助臨床上對(duì)AS的診斷，而Smad7基因的甲基化也為防治AS提供新的作用靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[4]BianL，HanG，ZhaoCW，etal.，The roleof Smad7 in oral mucositis，ProteinCell.2015：160-169.