白 皓， 杜偉立， 路宏朝， 王 令， 張 濤

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SSU1)屬于TDT(Tellurite-resistance/dicarboxylate transporter family)家族[1]，以亞硫酸外流泵的形式結(jié)合于細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽的外排[2-4]。一般來說，如果胞內(nèi)亞硫酸鹽濃度積累過高，亞硫酸鹽不能及時(shí)排至胞外會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鹽離子濃度過高，從而影響細(xì)胞代謝，造成細(xì)胞損傷等問題。在釀酒過程中SO2積累所轉(zhuǎn)化的亞硫酸鹽與膜受體結(jié)合會(huì)引起膜損傷[5]，細(xì)胞內(nèi)容物外流，抑制ATP合成，同時(shí)亞硫酸還通過與酶或代謝產(chǎn)物結(jié)合的多個(gè)代謝途徑[6]等多個(gè)水平影響微生物的活性，并由此導(dǎo)致細(xì)胞生長滯后、誘導(dǎo)孢子生成或細(xì)胞死亡等一系列異常表現(xiàn)，所以在釀酒業(yè)中釀酒酵母菌株對(duì)SO2耐受性的選擇是一項(xiàng)重要的指標(biāo)[7-8]。Avram等[9]研究了SSU1基因與FZF1轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FZF1的破壞導(dǎo)致亞硫酸鹽的敏感性，并闡述了FZF1對(duì)SSU1基因具有正向調(diào)節(jié)作用。Nardi T等[10]對(duì)生長在不同環(huán)境下的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，驗(yàn)證了SSU1基因所控制表達(dá)的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以調(diào)節(jié)亞硫酸鹽代謝，進(jìn)而證明酵母的SSU1基因可以促使亞硫酸外排，并是引起酵母菌株產(chǎn)生耐受性差異的主要原因之一。

為了進(jìn)一步獲得高水平表達(dá)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株，本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建多拷貝SSU1基因的釀酒酵母工程菌株，增加亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量，從而使其結(jié)合在細(xì)胞膜上并將亞硫酸鹽排出細(xì)胞外，避免亞硫酸鹽的積累對(duì)細(xì)胞的損傷。為生產(chǎn)實(shí)踐中開發(fā)亞硫酸鹽耐受性強(qiáng)的優(yōu)良工程菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真核表達(dá)載體JMB440、釀酒酵母AH109和大腸桿菌E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞由陜西理工大學(xué)分子遺傳研究室保存；RNA酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、蝸牛裂解酶和氨芐西林，購自寶生物工程(大連)有限公司。DL-2000 Marker、低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，購自Thermo Fisher公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒，購自BioFlux公司?；蛐蛄袦y(cè)序和引物合成由北京奧科鼎盛生物有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

1.2.2 釀酒酵母SSU1基因的擴(kuò)增

復(fù)蘇及培養(yǎng)釀酒酵母AH109，采用珠磨法提取酵母基因組DNA。以基因組DNA為模板，以SSU1 F，R為引物，PCR擴(kuò)增釀酒酵母SSU1基因，其PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Taq酶緩沖液5 μL，Mg2+6 μL，dNTP 5 μL，F(xiàn)，R引物各2 μL，模板1 μL，Taq酶0.3 μL，水28.7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA純化試劑盒回收SSU1基因片段。

1.2.3 JMB440-SSU1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切純化SSU1基因片段和骨架載體JMB440，然后用T4連接酶將SSU1基因和JMB440連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞。以SSU1F，R為引物采用菌落PCR，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切以及測(cè)序鑒定，獲得重組載體JMB440-SSU1。

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化以及SSU1基因表達(dá)檢測(cè)

通過酵母一步轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體JMB440-SSU1轉(zhuǎn)化至釀酒酵母AH109，涂布于缺少亮氨酸的酵母營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基(Synthetic Dropout Medium，SD)，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取酵母單克隆至3 mL無亮氨酸的SD液體培養(yǎng)基，在30 ℃，2000 r/min的搖床培養(yǎng)。以相同條件培養(yǎng)野生型AH109作為對(duì)照。當(dāng)酵母培養(yǎng)液OD600(在600 nm處溶液的吸光值)約0.5 h，收集菌體，磷酸緩沖液(PBS)重懸，加SDS-PAGE上樣緩沖液沸水浴10 min，冷凍離心取蛋白上清液，12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母SSU1基因的擴(kuò)增

通過珠磨法提取高質(zhì)量的釀酒酵母基因組DNA(圖1)，以此DNA為模板，PCR擴(kuò)增SSU1基因，其片段約為1600 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期的SSU1基因目標(biāo)片段1563 bp一致(圖2)，由此可以證明成功獲得SSU1基因片段。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1—3.釀酒酵母基因組DNA M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1—5.SSU1基因 圖1 酵母基因組DNA檢測(cè)結(jié)果 圖2 SSU1基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 構(gòu)建JMB440-SSU1

2.2 重組載體的鑒定

BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切純化SSU1基因片段和骨架載體JMB440，然后用T4連接酶將SSU1基因和JMB440連接獲得重組載體JMB440-SSU1(圖3)，連接產(chǎn)物JMB440-SSU1轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取12個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。經(jīng)電泳檢測(cè)，10個(gè)泳道均有單一清晰條帶，其大小約為1600 bp，與SSU1基因長度1563 bp相一致(圖4)；然后選取2，3號(hào)單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果表明能切出1600 bp的SSU1基因和骨架載體兩條帶，與預(yù)期的結(jié)果相一致(圖5)。

2.3 序列比對(duì)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將這兩個(gè)陽性克隆測(cè)序，結(jié)果表明：SSU1基因準(zhǔn)確地插入JMB440酵母表達(dá)載體，但是存在一個(gè)突變位點(diǎn)(圖6)，其SSU1的活性不會(huì)受到影響。為了進(jìn)一步了解SSU1的功能，本研究對(duì)SSU1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖7所示：SSU1蛋白與陽性克隆蛋白進(jìn)行比對(duì)，SSU1蛋白是由α螺旋和少量無規(guī)則卷曲組成的同型三聚體，無配體，結(jié)構(gòu)簡單，可能擁有更直接的功能作用。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1—12.單克隆菌落 M.DNA2000 Marker DL；1—2.兩個(gè)單克隆提取的質(zhì)粒雙酶切鑒定圖4 菌落PCR 圖5 質(zhì)粒酶切檢測(cè)結(jié)果

P1-SSU1是質(zhì)粒中SSU1基因序列；SSU1是NCBI中公布的基因序列圖6 測(cè)序結(jié)果與SSU1基因序列比對(duì)

P1-SSU1是質(zhì)粒中SSU1基因蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SSU1是SSU1序列蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.空白對(duì)照菌株；2—3.工程菌株圖7 陽性克隆預(yù)測(cè)蛋白與SSU1預(yù)測(cè)蛋白比對(duì) 圖8 SDS-PAGE檢測(cè)

2.4 SSU1表達(dá)鑒定

通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)SSU1基因表達(dá)，上樣量20 μL。結(jié)果表明在約45 KD處有一條與預(yù)期的SSU1基因所表達(dá)的蛋白分子量相一致，但是實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在相同水平下處理，其實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量比對(duì)照組高(圖8)。因此可以證明本研究成功構(gòu)建能夠高效表達(dá)SSU1基因重組釀酒酵母菌株AH109-JMB440-SSU1。

3 討 論

SSU1蛋白是一種參與釀酒酵母亞硫酸鹽代謝、調(diào)控亞硫酸鹽外流的質(zhì)膜蛋白[11]。在酵母細(xì)胞硫代謝過程中，SSU1基因編碼的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)以亞硫酸鹽外流泵的形式錨定于細(xì)胞膜，當(dāng)酵母細(xì)胞中亞硫酸鹽過度積累，過量的亞硫酸鹽可以通過亞硫酸鹽外流泵從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，減少其對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，SSU1無效突變體相比野生型，能夠積累更多的亞硫酸鹽，而表達(dá)多拷貝SSU1的酵母細(xì)胞積累顯著更少，同時(shí)多拷貝SSU1基因也能將一些不相關(guān)的亞硫酸鹽敏感菌株的亞硫酸鹽抗性提高3～8倍[13]。

本研究利用酵母表達(dá)載體可產(chǎn)生多拷貝基因的優(yōu)勢(shì)，成功構(gòu)建了JMB440-SSU1重組真核表達(dá)載體，測(cè)序鑒定結(jié)果與NCBI公布的SSU1基因序列一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SSU1基因存在較高的多態(tài)性，有利于酵母細(xì)胞的繁殖和代謝。然后將其轉(zhuǎn)化至AH109菌株中，完成了對(duì)釀酒酵母的優(yōu)化。通過成功構(gòu)建高水平表達(dá)SSU1的優(yōu)良酵母，一方面為獲得亞硫酸鹽耐受性強(qiáng)的優(yōu)良工程菌株起到指導(dǎo)作用，另一方面也為釀酒酵母在其他基因方面的優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。