趙麗倩, 仇愛(ài)鋒, 紀(jì)偉, 陳子雷, 莊惠生

?

亞致死劑量高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

趙麗倩1, 2, 仇愛(ài)鋒2, 紀(jì)偉2, 陳子雷3, 莊惠生1*

1. 上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200240 2. 浙江清華長(zhǎng)三角研究院, 浙江，嘉興 314006 3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 山東，濟(jì)南 250100

采用接觸濾紙法, 測(cè)定蚯蚓經(jīng)亞致死劑量高效氯氰菊酯染毒24 h、48 h和72 h后其體內(nèi)蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量的變化, 探討不同染毒時(shí)間和暴露濃度對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明, 在高效氯氰菊酯亞致死劑量下, 染毒24 h時(shí)蛋白含量在50 mg·L-1達(dá)到最大值, 而染毒72 h時(shí)蛋白含量在5 mg·L-1達(dá)到最大值, 表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)蛋白合成而長(zhǎng)時(shí)間下抑制。高效氯氰菊酯對(duì)SOD和CAT活力的誘導(dǎo)作用明顯, SOD活力在低濃度激活, 高濃度抑制; CAT活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì); MDA含量誘導(dǎo)作用不明顯, 短時(shí)間內(nèi)隨暴露濃度升高而升高, 但隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)趨于正常水平。因此SOD和CAT可作為蚯蚓受到氧化脅迫的指示指標(biāo), 而MDA無(wú)法作為指示指標(biāo)。此外, 各生化指標(biāo)對(duì)高效氯氰菊酯毒性效應(yīng)的敏感性存在差異, SOD活力影響最大, CAT次之, MDA最小。

高效氯氰菊酯; 蚯蚓; 蛋白含量; 抗氧化酶; 丙二醛含量

1 引言

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可避免需要使用農(nóng)藥提高農(nóng)作物產(chǎn)量, 農(nóng)藥殘留是施用農(nóng)藥后的常見(jiàn)現(xiàn)象[1]。擬除蟲菊酯是一類仿生合成的廣譜殺蟲劑, 能夠防治多種害蟲, 且殺蟲毒效比有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類高10—100倍[2]。高效氯氰菊酯(Beta-cypermethrin), 是一類典型的擬除蟲菊酯類殺蟲劑, 不溶于水, 但溶于有機(jī)溶劑, 對(duì)動(dòng)物具有神經(jīng)毒性。關(guān)于高效氯氰菊酯的毒性機(jī)制目前尚未完全了解, 國(guó)際上主要有兩種觀點(diǎn), 一種認(rèn)為擬除蟲菊酯直接同神經(jīng)膜上Na+通道相互作用而產(chǎn)生毒性[3]; 另一種認(rèn)為存在其它的靶標(biāo)或作用點(diǎn)。我國(guó)學(xué)者普遍認(rèn)同第一種觀點(diǎn)。相關(guān)研究表明, 施用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥后, 僅有1%—2%的藥物發(fā)揮有效作用成分作用, 余下均進(jìn)入環(huán)境中[4], 致使環(huán)境中農(nóng)藥的大量殘留, 引起環(huán)境污染與食品安全等相關(guān)問(wèn)題。

近年來(lái), 農(nóng)藥對(duì)環(huán)境危害研究主要著眼于陸生和水生動(dòng)物[5-8]。蚯蚓作為典型的土壤動(dòng)物, 其活動(dòng)可改善土壤結(jié)構(gòu), 提高土壤透氣性及土壤中有機(jī)成分的降解轉(zhuǎn)化, 還可作為土壤污染評(píng)價(jià)的指示生物[9]。此外, 蚯蚓處于陸生食物鏈底層, 可富集多種重金屬和農(nóng)藥, 再通過(guò)食物鏈傳遞影響高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物。在土壤毒理實(shí)驗(yàn)中, 試驗(yàn)蚯蚓的選擇對(duì)于研究農(nóng)藥對(duì)蚯蚓毒性的強(qiáng)弱具有極其重要性[10]。關(guān)于高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活力的研究鮮有報(bào)道。生物機(jī)體內(nèi)自由基的氧化與抗氧化酶通常處于動(dòng)平衡狀態(tài), 當(dāng)體內(nèi)自由基的清除酶和非酶系統(tǒng)被破壞, 這種動(dòng)平衡失調(diào)時(shí), 會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷, 所以細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性改變與膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷被認(rèn)為是污染物作用的結(jié)果。因此, 抗氧化酶活力的變化是體現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[11]。

本研究選取赤子愛(ài)勝蚓作為受試生物, 研究亞致死劑量下蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量的變化, 探討高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng), 以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)高效氯氰菊酯的環(huán)境毒性, 為制定農(nóng)藥環(huán)境安全標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

赤子愛(ài)勝蚓(), 購(gòu)自南京某專業(yè)蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng), 對(duì)不同污染物具有中等敏感性(例: 銅染毒2 d、7 d和14 d后, 銅與MDA含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.760、0.672和0.544)。試驗(yàn)前經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間, 選擇2 月齡以上、體形相似、體重約為200—300 mg, 生殖環(huán)帶明顯的性成熟的成年蚯蚓用于毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)正式開始前, 按OECD準(zhǔn)則方法[12], 利用氯乙酰胺檢查敏感性, 從中挑選14 d LC50值在10—50 mg·kg-1dw范圍內(nèi)的蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)試劑

99.5% 丙酮, 購(gòu)自杭州雙林化工試劑廠, 分析純; 99.1% 高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品, 購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所。考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、SOD、MDA和CAT測(cè)定試劑盒, 均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

玻璃培養(yǎng)皿(d=9 cm); 恒溫培養(yǎng)箱(SPX-290, 上海比郎儀器有限公司); 冷凍離心機(jī)(H3018DR, 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司); 紫外分光光度計(jì)(Cary 100 UV-Vis, 安捷倫(中國(guó))有限公司); 均質(zhì)攪拌機(jī)(FJ200-S, 杭州齊威儀器有限公司); 雪花制冰機(jī)(MINI 20, 上海比郎儀器有限公司); 恒溫水浴鍋(DKS-28, 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司); 超純水器(UPWS-I-20T, 杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)。

2.4 試驗(yàn)農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)計(jì)

由高效氯氰菊酯的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果可得, 赤子愛(ài)勝蚓的72 h 最高不致死濃度為50 mg·L-1, 據(jù)此設(shè)定高效氯氰菊酯的濃度分別為 5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1。

2.5 試驗(yàn)方法

2.5.1 樣本預(yù)處理

選擇性成熟的成年蚯蚓, 用超純水洗凈表面土壤后放入底部鋪有濾紙并潤(rùn)濕的1 L燒杯中, 用保鮮膜封口并扎孔, 將燒杯置于(20 ± 1)℃, 濕度為80%—85%的恒溫培養(yǎng)箱中, 于暗處培養(yǎng)一晝夜, 用于去除蚯蚓腸道內(nèi)雜物等[13]。

2.5.2 染毒試驗(yàn)

在直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中墊入直徑為9 cm雙層雙圈定性濾紙備用。試驗(yàn)時(shí)分別加入4 mL相應(yīng)濃度的農(nóng)藥試驗(yàn)溶液, 需注意將其均勻淋灑于雙層雙圈定性濾紙上。將培養(yǎng)皿在通風(fēng)櫥中通風(fēng)10 h, 待丙酮揮發(fā)后, 吸取4 mL的超純水均勻地潤(rùn)濕濾紙。

染毒試驗(yàn)時(shí), 用超純水將清腸的蚯蚓沖洗干凈, 并用濾紙吸干其表面水分。在每個(gè)添加好試驗(yàn)農(nóng)藥的玻璃培養(yǎng)皿中放入5條蚯蚓。然后在玻璃培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)側(cè)墊入已用3 mL超純水均勻潤(rùn)濕的直徑為11 cm的雙圈定性濾紙, 將玻璃培養(yǎng)皿蓋好以保證在72 h的試驗(yàn)過(guò)程中蚯蚓生活在溫度為20 ℃、濕度相對(duì)穩(wěn)定的避光環(huán)境中。試驗(yàn)組分為5個(gè)試驗(yàn)梯度, 每個(gè)濃度做3次重復(fù)。試驗(yàn)過(guò)程中不投喂食物, 定期觀察和記錄蚯蚓的中毒癥狀和行為, 在24 h、48 h和72 h分別采集實(shí)驗(yàn)蚯蚓樣本測(cè)定蛋白質(zhì)的含量和酶活力。試驗(yàn)期間無(wú)蚯蚓死亡。

2.5.3 空白對(duì)照的試驗(yàn)方法

空白試驗(yàn)中, 吸取4 mL的丙酮溶液均勻淋灑于墊有雙層雙圈定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中, 將其放入通風(fēng)櫥10 h, 待丙酮揮發(fā)后, 吸取4 mL的超純水均勻地潤(rùn)濕濾紙。

2.6 蛋白含量及酶活力或含量測(cè)定

2.6.1 蛋白含量的測(cè)定

準(zhǔn)確秤量待測(cè)樣本的重量, 按1∶9的重量(g)∶體積(mL)比例加入生理鹽水, 用冷凍離心機(jī)將冰水浴條件下機(jī)械勻漿好的蚯蚓組織樣本在2500 r·min-1和 4 ℃條件下, 離心10 min。用生理鹽水將離心后蚯蚓樣本上清液再按1∶9稀釋成1%的組織勻漿, 待測(cè)。

蚯蚓各樣本蛋白含量的測(cè)定采用Bradford[14]方法, 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白, 利用分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)定其吸光度。

2.6.2 SOD活力的測(cè)定

按照上述2.6.1 的方法進(jìn)行樣本前處理并制成10%的蚯蚓組織勻漿。取離心后的上清液待測(cè)。蚯蚓各樣本SOD活力的測(cè)定采用黃嘌呤氧化法[15], 通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基, 使硝基藍(lán)四氮唑被還原成紫紅色的亞硝酸鹽, 利用光分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)定其吸光度。

2.6.3 CAT活力的測(cè)定

按照上述2.6.1 的方法進(jìn)行樣本前處理并制成5%的蚯蚓組織勻漿。蚯蚓各樣本CAT活力的測(cè)定采用紫外分光法[16], 鉬酸銨溶液和經(jīng)CAT分解后殘留的過(guò)氧化氫反應(yīng)后產(chǎn)生的淡黃色絡(luò)合物在紫外分光光度計(jì)405 nm處的吸收峰測(cè)定。

2.6.4 MDA含量的測(cè)定

按照上述2.6.1 的方法進(jìn)行樣本前處理并制成10%的蚯蚓組織勻漿。MDA含量的檢測(cè)采用TBA法[17], 過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸(TBA)在酸性和高溫條件下形成紅色產(chǎn)物, 在532 nm處有紫外可見(jiàn)最大吸收峰。

2.7 數(shù)據(jù)處理

蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)數(shù)值由多個(gè)蚯蚓試驗(yàn)樣本的平均值得到。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS 18.0 軟件處理, 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean ± SD)表示, 且各數(shù)據(jù)之間相關(guān)性分析由SPSS 18.0 軟件完成。

3 結(jié)果與討論

3.1 高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

圖1為蚯蚓經(jīng)過(guò)5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內(nèi)蛋白含量及變化。

高效氯氰菊酯單一染毒試驗(yàn)中, 同一試驗(yàn)處理組24 h、48 h和72 h之間有顯著差異(<0.05)。與空白對(duì)照組相比, 部分處理組蛋白含量變化極顯著(<0.01), 如染毒24 h和48 h(除50 mg·L-1)的各濃度處理組。染毒24 h時(shí), 蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨著暴露濃度的增加而升高, 并在50 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值, 此時(shí)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量為空白對(duì)照組的1.68倍。染毒48 h時(shí), 蚯蚓體內(nèi)蛋白含量在40 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值, 為空白對(duì)照組的1.49倍, 隨后蛋白含量降低。染毒72 h時(shí), 蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨著暴露濃度的升高而降低, 且在暴露濃度為50 mg·L-1時(shí)低于空白對(duì)照組。此外, 由圖1中蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的變化可以發(fā)現(xiàn), 染毒24 h時(shí), 在50 mg·L-1時(shí)出現(xiàn)蛋白含量最高值, 而在染毒72 h可以發(fā)現(xiàn)暴露濃度為5 mg·L-1時(shí)出現(xiàn)蛋白含量最高值, 可推斷低濃度、長(zhǎng)時(shí)間染毒對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化的影響與高濃度、短時(shí)間的染毒產(chǎn)生的影響類似, 即暴露污染物的濃度和染毒時(shí)間決定了蚯蚓受外來(lái)污染物脅迫的機(jī)體損傷程度, 此發(fā)現(xiàn)與孫仕仙等[18]研究結(jié)果類似。

圖1 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

染毒初期, 有毒物質(zhì)經(jīng)表皮大量進(jìn)入蚯蚓體內(nèi), 破壞其機(jī)體功能和內(nèi)分泌系統(tǒng), 隨著農(nóng)藥暴露濃度的升高, 短期內(nèi)可能產(chǎn)生較多的應(yīng)激蛋白, 從而引起其體內(nèi)蛋白含量的升高[19]。高效氯氰菊酯暴露濃度和染毒時(shí)間延長(zhǎng), 可能增加蚯蚓其體內(nèi)生產(chǎn)正常生理功能的蛋白質(zhì)或者誘導(dǎo)產(chǎn)生一些可以與其絡(luò)合的蛋白質(zhì)去應(yīng)對(duì)農(nóng)藥高效氯氰菊酯的污染負(fù)荷[20]。隨著染毒時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng), 胃毒和經(jīng)表皮毒性持續(xù)共同作用, 破壞其蛋白質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)源, 造成蛋白含量的降低[21]。

3.2 高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD活力的影響

圖2為蚯蚓經(jīng)過(guò)5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內(nèi)SOD活力及變化。

蚯蚓經(jīng)高效氯氰菊酯處理后, 其體內(nèi)SOD活力的變化基本一致, 不同試驗(yàn)濃度組間蚯蚓SOD活力差異顯著(<0.05), 同一試驗(yàn)處理組24 h、48 h和72 h之間差異顯著(<0.05)。主要表現(xiàn)為SOD活力與空白對(duì)照相比先降低, 然后逐漸升高, 再持續(xù)降低。與空白對(duì)照組相比, 各染毒處理組的SOD活力變化極顯著(<0.01)。與空白對(duì)照組相比, 各染毒處理組的SOD活力變化幅度更大。在3個(gè)測(cè)定時(shí)段中, 蚯蚓體內(nèi)SOD活力的高低順序?yàn)? 48 h＞24 h＞72 h。染毒24 h, SOD活力在低濃度時(shí)升高, 在20 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值, 之后隨濃度升高而降低, 出現(xiàn)催化劑量反應(yīng), 促進(jìn)SOD的產(chǎn)生去承擔(dān)農(nóng)藥負(fù)荷, 這與唐學(xué)璽和張培玉等的研究結(jié)果類似[22], 即生物體受到環(huán)境污染物少量脅迫時(shí), 會(huì)促進(jìn)SOD的產(chǎn)生, 使得SOD活力會(huì)升高, 而當(dāng)其受到毒物重度脅迫時(shí), SOD活力往往會(huì)降低。染毒48 h后, 蚯蚓體內(nèi)SOD活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 可能是SOD是蚯蚓進(jìn)行抗氧化防御的第一道防御, 對(duì)氧化損傷比較敏感[23]。蚯蚓染毒后體內(nèi)的SOD活力開始抵御氧化損傷并逐漸適應(yīng), 但隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng), 過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)超出機(jī)體的抗氧化能力, 導(dǎo)致SOD活力的降低[24]。

3.3 高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT活力的影響

圖3為蚯蚓經(jīng)過(guò)5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內(nèi)CAT活力及變化。

由圖3可見(jiàn), 在低濃度短時(shí)間內(nèi), 蚯蚓體內(nèi)CAT活力逐漸升高, 而高濃度長(zhǎng)時(shí)間下CAT活力抑制。與空白對(duì)照組相比, 試驗(yàn)周期內(nèi)部分處理組CAT活力變化極顯著(<0.01): 如染毒24 h的10、20和40 mg·L-1, 染毒48 h的 20 mg·L-1濃度組, 其CAT活力均顯著高于空白對(duì)照組, 分別為對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組的1.23、1.24、1.24和1.16倍。而染毒48 h 的5和40 mg·L-1, 染毒72 h的50 mg·L-1濃度組, 其CAT活力顯著低于空白對(duì)照組, 分別為對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組的0.74、 0.88和0.81倍。染毒24 h時(shí), 10、20和40 mg·L-1的高效氯氰菊酯可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)CAT活力上升; 染毒48 h時(shí), 蚯蚓體內(nèi)CAT活力逐漸降低。染毒72 h時(shí), 對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT活力產(chǎn)生誘導(dǎo)升高溶液的濃度隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而降低, 染毒48 h到72 h時(shí), 處理組誘導(dǎo)作用濃度由20 mg·L-1降低到10 mg·L-1。蚯蚓抗氧化酶系統(tǒng)應(yīng)對(duì)氧化損傷的主要機(jī)理是, SOD催化O2-和H+轉(zhuǎn)化為H2O2和O2, 隨后CAT又將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2[25]。染毒24 h后, SOD活力的提高可能增加了H2O2的累積, 刺激CAT活力上升; 而隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng), 過(guò)量H2O2的積累也會(huì)抑制CAT活力, 從而造成CAT活力降低。

圖2 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD活力的影響

圖3 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT活力的影響

3.4 高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響

圖4為蚯蚓經(jīng)過(guò)5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內(nèi)MDA含量及變化。

圖4 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對(duì)蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響

MDA作為膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物, 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度及應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)弱的指示指標(biāo), MDA含量與機(jī)體損傷成正比[26]。由圖4可見(jiàn), 蚯蚓經(jīng)高效氯氰菊酯單一染毒初期, 各試驗(yàn)處理組蚯蚓體內(nèi)MDA含量出現(xiàn)明顯上升: 如染毒24 h時(shí)10、20、40和50 mg·L-1試驗(yàn)處理組顯著高于空白對(duì)照組(< 0.01), 分別為對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組的1.28、1.37、1.80和1.89倍, 且各蚯蚓試驗(yàn)濃度組間MDA含量變化幅度較大, 達(dá)17.84%—89.35%, 并在50 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高值。這可能是由于污染物造成生物體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激效應(yīng), 但因其自身調(diào)節(jié)能力限制, 蚯蚓體內(nèi)累積過(guò)量的氧化自由基, 引起其機(jī)體細(xì)胞功能缺失導(dǎo)致膜的過(guò)氧化, 并伴隨MDA含量增加[27]。染毒48 h, 由于體內(nèi)污染物代謝物質(zhì)的累積, 導(dǎo)致其體內(nèi)MDA含量略有所增加。此外, 隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng), 蚯蚓體內(nèi)MDA含量變化幅度不大, 逐漸趨于平穩(wěn), 是因?yàn)槎嘤嗟幕钚匝醣豢寡趸溉コ? 使得蚯蚓體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和去除處于動(dòng)平衡狀態(tài)[26], 染毒72 h, 試驗(yàn)處理組和空白對(duì)照組的MDA含量均無(wú)明顯差異(>0.05)。蚯蚓遭受環(huán)境脅迫嚴(yán)重時(shí), 氧化應(yīng)激反應(yīng)能引起生物機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)總量的下降, 并且成分發(fā)生改變, 造成生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化[28]。由整個(gè)染毒時(shí)間來(lái)看, 蚯蚓體內(nèi)MDA含量在高濃度組的波動(dòng)幅度明顯大于低濃度組, 且MDA含量的變化是農(nóng)藥濃度和染毒時(shí)間的綜合結(jié)果, 機(jī)體短時(shí)間內(nèi)的自由基損傷可修復(fù), 但長(zhǎng)時(shí)間染毒造成的機(jī)體損傷無(wú)法修復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果也側(cè)面表明外源污染物的加入可引起生物體內(nèi)MDA含量增加的現(xiàn)象[29]。

4 結(jié)論

1)亞致死劑量高效氯氰菊酯染毒24 h, 蛋白含量在50 mg·L-1達(dá)到最大值, 而染毒72 h, 蛋白含量在5 mg·L-1達(dá)到最大值?？傻贸鲛r(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響表現(xiàn)為低濃度、長(zhǎng)時(shí)間暴露與高濃度、短時(shí)間暴露的作用類似, 即暴露污染物的濃度和染毒時(shí)間決定了蚯蚓受外來(lái)污染物脅迫的機(jī)體損傷程度。

2)高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活力有影響, SOD活力在低濃度激活, 高濃度抑制; CAT活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì); MDA含量在短時(shí)間內(nèi)隨暴露濃度升高而升高, 而后恢復(fù)正常水平。

3)高效氯氰菊酯作用下, 蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT和MDA的敏感性不同, SOD活力影響最大, CAT次之, MDA最小。試驗(yàn)研究結(jié)果可為高效氯氰菊酯的土壤生態(tài)毒理診斷提供參考。

[1] CHEN Chen, WANG Yanhua, ZHAO Xueping, et al. Comparative and combined acute toxicity of butachlor, imidacloprid and chlorpyrifos on earthworm,[J]. Chemosphere, 2014, 100(3): 111.

[2] 王嘯. 擬除蟲菊酯離子液體固相微萃取技術(shù)的研究[D]. 天津: 天津科技大學(xué), 2012.

[3] AEL, T N. Modification of sodium channel kinetics by the insecticide tetramethrin in crayfish giant axons[J]. Neuro-toxi-cology, 1981(2): 213–219.

[4] 全國(guó)農(nóng)藥殘留試驗(yàn)研究協(xié)作組. 農(nóng)藥殘留量實(shí)用檢測(cè)方法手冊(cè)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2001.

[5] 朱友芳, 洪萬(wàn)樹. 敵百蟲對(duì)中國(guó)花鱸的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 30(7): 1484–1490.

[6] 于偉麗, 杜軍輝, 胡延萍, 等. 六種殺蟲劑對(duì)小地老虎的毒力及對(duì)土壤生物安全性評(píng)價(jià)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2012, 39(3): 277–282.

[7] 李海波, 謝學(xué)文, 張國(guó)森, 等. 4種土壤處理劑對(duì)日光溫室蚯蚓的防治效果[J]. 中國(guó)蔬菜, 2015, 1(9): 58–60.

[8] WANG Yanhua, CANG Tao, ZHAO Xueping, et al. Com-parative acute toxicity of twenty-four insecticides to earthworm,[J]. Ecotoxicology and Environ-mental Safety, 2012, 79(6): 122–128.

[9] YASMIN S, D'SOUZA D. Effects of pesticides on the growth and reproduction of earthworm: a review [J]. Applied & Environmental Soil Science, 2010, 2010(3): 1–9.

[10] 姜錦林, 程燕, 卜元卿, 等. 農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)和繁殖毒性及其在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2014, 35(9): 23–32.

[11] 白桂芬, 曾小波. 敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)3種抗氧化酶活性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, (1): 22–26.

[12] GENERAL C. Test No.207: Earthworm, Acute Toxicity Tests[J]. Oecd Guidelines for the Testing of Chemicals, 1984, 1: 1–9.

[13] 王凱. 新煙堿類殺蟲劑對(duì)蚯蚓毒性及作用機(jī)制研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[14] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical bioche-mistry, 1976, 72(1-2): 248–254.

[15] 呂淑霞. 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

[16] 楊健, 趙麗敏, 陳巧燕, 等. 水力負(fù)荷對(duì)生物濾池中蚯蚓抗氧化酶和消化酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2009, 30(4): 1029–1035.

[17] BIGWOOD T, READ G. Pseudo malonaldehyde activity in the thiobarbituric acid test[J]. Free Radical Research, 1989, 6(6): 387.

[18] 孫仕仙, 陶瑞, 張慶蛟, 等. 樂(lè)果和殺蟲雙污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(2): 298–303.

[19] 邰托婭. 土壤中重金屬和農(nóng)藥復(fù)合污染對(duì)蚯蚓毒性效應(yīng)的研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[20] 何應(yīng)森, 徐曉燕, 高曉玲. 土壤Cd污染與蚯蚓體內(nèi)纖對(duì)纖維素酶活性變化的關(guān)系(英文)[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù): 英文版, 2014, 15(12): 2156–2158.

[21] 馮磊. 三種新煙堿類殺蟲劑對(duì)蚯蚓的影響[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2014.

[22] 唐學(xué)璽, 張培玉. 蒽對(duì)黑鲪超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2000, 24(3): 217–220.

[23] APEL K, HIRT H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology, 2004, 55(1): 373–399.

[24] VIEIRA M C, TORRONTERAS R, CORDOBA F, et al. Acute toxicity of manganese in goldfish Carassius auratus is associated with oxidative stress and organ specific antioxidant responses[J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2012, 78(3): 212–217.

[25] LI Ying, SHI Jiaqi, QU Ruijuan J, et al. Toxicity assessment on three direct dyes (D-BLL, D-GLN, D-3RNL) using oxidative stress bioassay and quantum parameter calculation[J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2012, 86(4): 132–140.

[26] 吳爾苗, 王軍良, 趙士良, 等. 菲和芘單一及復(fù)合污染對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(5): 1077–1085.

[27] FENG Mingbao, QU Ruijuan, WANG Chao, et al. Com-parative antioxidant status in freshwater fish Carassius auratus exposed to six current-use brominated flame retar-dants: A combined experimental and theoretical study[J]. Aquatic toxicology (Amsterdam, Netherlands), 2013, 140- 141(1): 314–323.

[28] LU Mang, ZHANG Zhongzhi, SU Xiaoli, et al. Effect of copper on in vivo fate of BDE-209 in pumpkin[J]. Journal of Hazardous Materials, 2013, 262C (8): 311–317.

[29]NOVAIS S C, GOMES S I, GRAVATO C, et al. Repro-duction and biochemical responses in Enchytraeus albidus (Oligochaeta) to zinc or cadmium exposures[J]. Environ-mental Pollution, 2011, 159(7): 1836–1843.

Effects of beta-cypermethrin on the biochemical indices of earthworms under the sublethal dose

ZHAO Liqian1, 2, QIU Aifeng2, JI Wei2, CHEN Zilei3, ZHUANG Huisheng1*

1. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China 2. Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Zhejiang, Jiaxing 314006, China 3. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agricultural Products, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China

In this study, the filter paper contact method was conducted to investigate the toxic effects of beta-cypermethrin under the sublethal dose after 24 h, 48 h and 72 h to discuss the content of protein, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and the content of Malondialdehyde (MDA) in earthworm () in different exposure time and concentration. Different changes in the tested earthworm of protein content, SOD, CAT activity and MDA content were observed for application of beta-cypermethrin. The results showed that the protein content reached the maximum at 50 mg·L-1in 24 h, while the protein content reached the maximum at 5 mg·L-1in 72 h under the sublethal dose of beta-cypermethrin. Protein content showed a time-dependent effect with the beta-cypermethrin: the protein content increased in short time, while it decreased in the long time compared to the controls. Results of exposure tests indicated that beta-cypermethrin had a promoting effect upon the induction of the activities of SOD and CAT in earthworm.The activity of SOD increased in the low concentration group, while it decreased in the high concentration group. The activity of CAT showed a trend of increasing at first and then decreasing during the exposure time. Nevertheless, it was not so obvious to the changes of MDA content, which increased with the exposure concentration in a short time and tended to normal level with the exposure time prolonged. Thus, SOD and CAT could be the indicators of oxidative stress in earthworm, and MDA could not. In addition, the biochemical indicators had different sensitivity to the toxic effects of beta-cypermethrin; SOD was the greatest, followed by CAT and MDA was the minimum.

beta-cypermethrin; earthworm; protein content; antioxidant enzymes; malondialdehyde content

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.04.008

X171.5

A

1008-8873(2018)04-065-07

2017-06-15;

2017-07-21

混合農(nóng)藥聯(lián)合毒性效應(yīng)與膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(ZR2016YL027); 生物標(biāo)志物在杭州灣海域生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的研究與示范(2016C34010)

趙麗倩(1988—), 女, 浙江嘉興人, 碩士研究生, 主要從事環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)研究, E-mail: liqian_zhao@hotmail.com

莊惠生, 男, 博士, 教授, 從事環(huán)境評(píng)價(jià)研究, E-mail: hszhuang@sjtu.edu.cn

趙麗倩, 仇愛(ài)鋒, 紀(jì)偉, 等. 亞致死劑量高效氯氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2018, 37(4): 65-71.

ZHAO Liqian, QIU Aifeng, JI Wei, et al. Effects of beta-cypermethrin on the biochemical indices of earthworms under the sublethal dose[J]. Ecological Science, 2018, 37(4): 65-71.