趙淑婷， 雷 蕾， 程靜新

(同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200120)

宮頸癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年增高[1]。即使在早期宮頸癌根治性切除術(shù)后，仍大約有20%～30%的患者復(fù)發(fā)[2-3]?；煆V泛用于治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病[4]。

苦參堿是一種從豆科槐屬植物中提取的生物堿，具有利尿、抗病原體、抗肝炎病毒等作用，且無明顯的毒性作用[5-7]。既往研究[8-10]表明，苦參堿可能是通過抑制癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞自噬而對胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌等發(fā)揮抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用極其復(fù)雜，涉及對細胞增殖、凋亡及周期的影響。本研究旨在探討苦參堿對宮頸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用與H2AX是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

苦參堿(分析純)購自上海源葉公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)購自美國Corning公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自日本同仁公司；Cell-Light EdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit購自廣州銳博公司；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC試劑盒、Transwell小室購自美國BD公司；鼠單克隆抗體β-actin購自美國Proteintech公司；兔單克隆抗體H2AX、P38、抗鼠IgG及抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細胞系

人宮頸癌SiHa、C33A細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。SiHa細胞用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；C33A細胞用含有10%血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。以上細胞置于37℃，5% CO2飽和濕度下貼壁培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況1～2d換液一次。

1.3 方法

1.3.1 CCK8試驗 將對數(shù)生長期細胞按2×103/孔接種于96孔板，貼壁后更換不同濃度苦參堿(0～2mg/mL)培養(yǎng)基，于24、48、72h后按照CCK8說明書配制CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中溫育2h，用酶標儀測定450nm處吸光度值(A450)。

1.3.2 EdU法 將2×103個宮頸癌細胞接種于96孔板，貼壁后更換培養(yǎng)基，24h后按EdU試劑盒說明配置溶液，試劑A液孵育2h，4%多聚甲醛固定，甘氨酸脫色，滲透劑孵育。Apollo?反應(yīng)溶液避光、室溫、孵育后Hoechst33342反應(yīng)液避光室溫孵育，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 流式細胞術(shù) 將細胞種于6孔板培養(yǎng)12h后，更換正常及含0.5mg/mL苦參堿的培養(yǎng)基，作用24h后的細胞，用預(yù)冷PBS充分洗滌細胞3次，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書配置溶液，細胞用195μL 結(jié)合緩沖液和5μL Annexin V-FITC室溫避光孵育10min，然后加入10μL碘化丙啶室溫避光孵育10min，上機檢測細胞凋亡率。

1.3.4 細胞凋亡與壞死檢測 將5×103個宮頸癌細胞接種于6孔板，貼壁后更換不同濃度苦參堿培養(yǎng)基，作用24h后，先加入Hoechst33342染液4℃避光孵育30min，再加入碘化丙啶染液4℃避光孵育30min進行雙標記染色，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 細胞遷移試驗 在Transwell小室中加入200μL(1×106個/mL)不同處理后的無血清細胞懸液，底部加入600μL含10%血清的培養(yǎng)液。置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24h，將小室置于4%多聚甲醛溶液中固定后結(jié)晶紫染色，PBS輕輕沖洗小室，用棉棒將室頂細胞輕輕擦去，晾干后于倒置顯微鏡觀察，隨機取3個視野進行拍照，統(tǒng)計細胞遷移率。

1.3.6 劃痕實驗 將細胞以每孔1×106密度接種于6孔板中，待細胞貼壁長滿后時用10μL槍頭垂直劃一條直線，PBS沖洗去除劃下細胞，更換含(0、0.5mg/mL)苦參堿的無血清的培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡下分別在0、24h拍照。

1.3.7 Western印跡法檢測 干預(yù)后的細胞經(jīng)預(yù)冷PBS漂洗后，用RIPA裂解液處理后輕輕刮下細胞，冰上反應(yīng)30min后超聲并離心獲得各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，與5×SDS蛋白上樣緩沖溶液混合，100℃下變性8min。每孔上樣30μg蛋白，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1h后加入相應(yīng)一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，隨后加入二抗(1∶10000)，室溫孵育1h，進行ECL反應(yīng)。利用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿對SiHa/C33A細胞增殖的影響

CCK8法檢測0、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL苦參堿誘導(dǎo)24、48、72h后對宮頸癌細胞SiHa、C33A細胞增殖的影響。相同作用時間下，抑制作用隨苦參堿濃度的升高而增強，相同濃度下，抑制作用隨苦參堿作用時間的延長而增強，在苦參堿濃度高于0.5mg/mL時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EdU實驗結(jié)果顯示，1mg/mL苦參堿作用后細胞的增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 苦參堿對SiHa/C33A細胞凋亡的影響

通過細胞凋亡與壞死檢測Hochest33342和碘化丙啶雙染實驗，評估苦參堿對宮頸癌細胞凋亡形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，苦參堿作用后的細胞密度明顯降低，出現(xiàn)亮藍色，核染色質(zhì)固縮染色體碎裂、固縮的細胞被染成亮藍色或淡紅色。通過流式細胞術(shù)，檢測結(jié)果顯示，苦參堿誘導(dǎo)細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 苦參堿對SiHa/C33A細胞遷移的影響

通過Transwell實驗與劃痕實驗檢測苦參堿對宮頸癌遷移能力的影響。Transwell實驗結(jié)果顯示： 較正常對照組，苦參堿作用后的宮頸癌細胞的穿膜數(shù)量均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示： 處理24h時，正常對照組細胞劃痕寬度大于苦參堿作用后的宮頸癌細胞，即遷移能力受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 苦參堿對SiHa/C33A細胞H2AX、P38表達的影響

通過Western印跡法檢測苦參堿對γH2AX、pP38蛋白水平的影響，結(jié)果顯示苦參堿隨著藥物濃度增高，γH2AX、pP38的表達顯著增高，即H2AX、P38磷酸化水平隨著苦參堿濃度增高而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖1 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A增殖的影響Fig.1 The effect of matrine on SiHa and C33A cell proliferationA： CCK8實驗檢測不同時間點、不同苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響；B： EdU法檢測苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響；與對照組相比，*P<0.05

圖2 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A凋亡的影響Fig.2 The effect of matrine on SiHa and C33A cell apoptosisA： 細胞凋亡實驗對宮頸癌細胞凋亡的檢測；B： 流式細胞術(shù)對宮頸癌細胞凋亡的檢測；與對照組相比，*P<0.05

圖3 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A侵襲和遷移的影響Fig.3 The effect of matrine on invasion and migration of SiHa and C33A cellsA： 宮頸癌細胞侵襲能力；B： 宮頸癌細胞遷移能力；與對照組相比，*P<0.05

圖4 苦參堿對宮頸癌細胞SiHa/C33A中H2AX基因表達的影響Fig.4 The effect of matrine on the expression of H2AX in cervical cancer cells與0mg/mL苦參堿組相比，*P<0.05

2.5 H2AX磷酸化對苦參堿作用的宮頸癌細胞增殖、遷移的影響

在宮頸癌細胞SiHa中穩(wěn)轉(zhuǎn)H2AX-wt和H2AX-139m(含有Ser139突變以阻斷磷酸化)后加入苦參堿，檢測H2AX的磷酸化不同對宮頸癌細胞增殖、遷移的影響。結(jié)果顯示，與H2AX-wt組相比，苦參堿對H2AX-139m組宮頸癌細胞的增殖抑制程度減低，遷移率明顯增強，即H2AX磷酸化的阻斷可降低苦參堿對宮頸癌細胞的抑增殖、抑遷移的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 H2AX磷酸化對苦參堿作用的宮頸癌細胞增殖、遷移的影響Fig.5 The effect of H2AX phosphorylation on proliferation and migration in cervical cancer cellsA： CCK8法檢測苦參堿在H2AX不同磷酸化下對宮頸癌細胞48h增殖的抑制率的影響；B： Transwell實驗檢測苦參堿在H2AX不同磷酸化下對宮頸癌細胞遷移的影響；與H2AX-wt組相比，*P<0.05

2.6 苦參堿通過P38信號通路對宮頸癌細胞H2AX磷酸化的影響

在宮頸癌細胞SiHa中加入P38磷酸激酶抑制劑SB202190，通過Western印跡法檢測P38磷酸化被抑制后對γH2AX、pP38表達的影響。結(jié)果顯示，加入抑制劑后，P38信號磷酸化通路被抑制，同時H2AX磷酸化水平也隨之降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 苦參堿通過P38信號通路對宮頸癌細胞H2AX磷酸化的影響Fig.6 The effect of Matrine on the phosphorylation of H2AX in cervical cancer cells through P38 signaling pathway與苦參堿組相比，*P<0.05

3 討 論

苦參堿對多種腫瘤有抑制作用，且毒副作用較小，是一種應(yīng)用于臨床的高效、低毒的新型抗腫瘤藥。既往研究[8,11]表明，苦參堿在病毒性肝炎、心律失常、皮膚炎癥等的治療中廣泛應(yīng)用，且與標準療法聯(lián)合應(yīng)用能顯著改善癌癥患者的生活質(zhì)量和預(yù)后，顯示其作為抗癌藥物的潛力。然而，其對腫瘤抑制作用的具體機制目前還不明確，尤其是在宮頸癌中。在本實驗中，探究不同濃度苦參堿對人宮頸癌細胞系SiHa和C33A細胞功能的影響，及與P38/H2AX基因表達的相關(guān)性，以期揭示苦參堿對宮頸癌抑癌作用的機制。

腫瘤細胞的增殖能力與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。本研究驗證了苦參堿對宮頸癌細胞增殖的抑制，苦參堿對宮頸癌SiHa和C33A細胞的增殖顯著抑制，且呈劑量依賴。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與細胞的增殖分化有關(guān)，還與細胞的凋亡障礙有密切關(guān)系，細胞凋亡是維持機體自身穩(wěn)態(tài)所必須的生理性細胞自殺過程，苦參堿在肝細胞癌中可通過凋亡誘導(dǎo)因子的核轉(zhuǎn)位而產(chǎn)生的細胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，苦參堿可促進細胞凋亡。遷移和侵襲是評價宮頸癌預(yù)后的重要指標并提示治療后效果，遷移能力強的細胞更具有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛能[12]。本實驗通過Transwell實驗和劃痕實驗檢測苦參堿對宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)苦參堿在宮頸癌中顯著抑制細胞的遷移能力。這一結(jié)果與前列腺癌的低遷移率一致[5]，進一步驗證了苦參堿對宮頸癌細胞遷移的抑制作用[13]；通過CCK8、EdU等實驗技術(shù)，針對細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多角度綜合證明苦參堿對宮頸癌的抑增殖、促凋亡、抑轉(zhuǎn)移等抗腫瘤作用

關(guān)于苦參堿對腫瘤抑制作用的機制研究[14-15]認為，抑制作用可能與miR-21/PTEN/Akt通路、AKT/GSK3β/β-Catenin等通路相關(guān)。本研究通過苦參堿作用于宮頸癌細胞，證明苦參堿隨濃度增加可梯度增加γH2AX、pP38的表達，提示苦參堿的抑癌作用可能與H2AX相關(guān)。H2AX屬于編碼組蛋白H2A家族，參與細胞的增殖和DNA的修復(fù)[16]。DNA損傷可導(dǎo)致增殖失控和驅(qū)動惡性腫瘤的形成H2AX在Ser139位點發(fā)生磷酸化進而調(diào)控細胞增殖、細胞凋亡、DNA的修復(fù)中起重要作用。在真核細胞中，生物、物理及化學(xué)因素等可使DNA損傷而形成γH2AX。在越來越多的證據(jù)[17]表明，γH2AX參與多種人類惡性腫瘤的凋亡過程中。H2AX磷酸化可由ATM、ATR和DNA-PKcs催化[18]。研究[19-20]報道，H2AX的磷酸化可通過P38絲裂原活化蛋白激酶途徑調(diào)控細胞的凋亡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，苦參堿抑制宮頸癌增殖、遷移時，γH2AX、pP38的表達增加，提示苦參堿可能是通過誘導(dǎo)H2AX磷酸化進而發(fā)揮作用。為證明H2AX是通過磷酸化激活發(fā)揮作用，通過抑制H2AX的磷酸化發(fā)現(xiàn)苦參堿對增殖、遷移的抑制作用解除。為探究γH2AX的作用通路，通過阻斷H2AX上游基因P38的磷酸化，結(jié)果證實P38磷酸化的阻斷可抑制γH2AX的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠有效抑制宮頸癌SiHa/C33A細胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)細胞凋亡，并證實苦參堿通過P38信號通路使H2AX(Ser139)位點磷酸化發(fā)揮抑增殖、抑遷移作用。本研究下一步將繼續(xù)闡述苦參堿有無其他通路調(diào)控H2AX的表達，為宮頸癌輔助治療的臨床前和臨床評價奠定基礎(chǔ)。