唐榮偉 田玫瑰 唐玲 杜歡 范剛 潘正

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）19-2644-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.12

摘 要 目的：為烏梅的質(zhì)量控制以及功效物質(zhì)的全面檢測(cè)和開(kāi)發(fā)利用提供參考。方法：以氘代甲醇-重水（1 ∶ 0.3，V/V）為提取溶劑，在25 ℃下采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列（ZGPR）壓制水峰建立10批不同來(lái)源烏梅藥材的氫核磁共振（1H-NMR）指紋圖譜，通過(guò)“加標(biāo)準(zhǔn)品定性”試驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)進(jìn)行信號(hào)歸屬，采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算10批不同來(lái)源烏梅藥材1H-NMR指紋圖譜的相似度，并采用主成分分析（PCA）法進(jìn)行藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果：從烏梅藥材中同時(shí)檢測(cè)出19種化合物，包括綠原酸、檸檬酸、丁二酸、乙酸、丙氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸等。其中，乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸為首次從烏梅藥材中檢測(cè)到。10批烏梅藥材指紋圖譜的相似度均>0.9，平均為0.974。 PCA結(jié)果顯示，前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為90.3%，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。結(jié)論：建立的1H-NMR方法具有整體性和分析快等優(yōu)點(diǎn)，可為烏梅的質(zhì)量控制和功效物質(zhì)的全面檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞 烏梅；氫核磁共振；指紋圖譜；主成分分析；質(zhì)量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for the quality control of Prunus mume， comprehensive detection， development and utilization of active ingredients. METHODS： Using deuterated methanol and deuterium oxide （1 ∶ 0.3， V/V） as extracting solvent， 1H-NMR fingerprints of 10 batches of P. mume from different sources were established by standard presaturated pulse sequence （ZGPR） at 25 ℃. The signal was assigned through “adding standard substance qualitation” trial， database comparison and related literature comparison. The similarity of 1H-NMR fingerprints was calculated for 10 batches of P. mume from different sources by using correlation coefficient method. The quality of medicinal material was evaluated by principal component analysis （PCA）. RESULTS： A total of 19 compounds were detected in P. mume， among which chlorogenic acid， citric acid， succinic acid， acetic acid， alanine， valine， γ-aminobutyric acid， etc. Among them， acetic acid， γ-aminobutyric acid and succinic acid were detected for the first time. Moreover， the similarity of 1H-NMR fingerprinting of 10 samples was higher than 0.9， being 0.974 in average. The results of PCA showed that accumulative contribution rate of former 2 main components was 90.3%， which was consistent with the similarity evaluation. CONCLUSIONS： The established 1H-NMR method has the advantages of embodying integrity and rapid analysis， and can provide reference for the quality control of P. mume， and comprehensive testing of active ingredients.

KEYWORDS Prunus mume； 1H-NMR； Fingerprint； Principal component analysis； Quality control

烏梅又名酸梅、梅實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為薔薇科植物梅[Prunus mume （Sieb.） Sieb.et Zucc.]的干燥近成熟果實(shí)。烏梅具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，已入選國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)藥食兩用名單（2002年版）。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）記載，烏梅有斂肺、澀腸、生津、安蛔的功效，可用于治療肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱消渴、蛔厥嘔吐腹痛等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏梅具有明顯的抗菌、降血脂、鎮(zhèn)靜、抗肝纖維化等生物活性[2]?？梢?jiàn)，烏梅具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和發(fā)展前景。烏梅在全國(guó)各地均有栽培，主產(chǎn)于四川、貴州、福建等地。研究表明，烏梅中主要含有齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分（次生代謝產(chǎn)物），以及檸檬酸、蘋果酸、乳酸等有機(jī)酸類成分和氨基酸類、糖類等成分（初生代謝產(chǎn)物）[3]。目前，已有文獻(xiàn)開(kāi)展了烏梅藥材中特征化學(xué)成分的高效液相色譜（HPLC）法含量測(cè)定研究[4-5]。然而，常規(guī)HPLC測(cè)定方法大都只能分析幾個(gè)或某一類成分，很難同時(shí)分析屬于不同類型的化學(xué)成分。

近年來(lái)，隨著儀器及信號(hào)處理技術(shù)的發(fā)展，核磁共振方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性得到極大提高。氫核磁共振（Hydrogen-1 nuclear magnetic resonance，1H-NMR）分析技術(shù)具有體現(xiàn)整體性、無(wú)偏向性、分析快速等特點(diǎn)[6-7]，廣泛應(yīng)用于中藥的品種鑒定、質(zhì)量控制及道地性評(píng)價(jià)等[8-12]。1H-NMR技術(shù)提供了一個(gè)整體、宏觀的分析平臺(tái)，能同時(shí)檢測(cè)藥材中的整體化學(xué)成分，有利于提高中藥的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)水平[8]。本研究參考烏梅藥材中已發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分[3]，充分利用1H-NMR分析技術(shù)的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)，首次從整體上檢測(cè)分析烏梅中的初生和次生代謝產(chǎn)物，建立1H-NMR指紋圖譜，以期為烏梅的質(zhì)量控制及功效物質(zhì)的全面檢測(cè)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

400 MHz型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司）；BP221S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

本研究共收集了10 批烏梅藥材樣品（藥材來(lái)源見(jiàn)表1），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院范剛副研究員鑒定均為薔薇科植物梅P. mume的干燥近成熟果實(shí)；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413，純度：98.5%）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-200505，純度：98.7%）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-200517，純度：98.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；氘代甲醇（CD3OD）、重水（D2O）、3-（三甲基硅基）-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉鹽（TSP）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；蘋果酸對(duì)照品（批號(hào)：M0020，純度：99.0%）、酒石酸對(duì)照品（批號(hào)：T0001，純度：99.0%）、抗壞血酸對(duì)照品（批號(hào)：A0537，純度：99.0%）、乳酸對(duì)照品（批號(hào)：L0226，純度：98.5%）、檸檬酸對(duì)照品（批號(hào)：C1949，純度：98.0%）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 1H-NMR測(cè)定條件

測(cè)定溫度為25 ℃；觀察頻率為400.13 MHz；脈沖延遲時(shí)間為2 s；譜寬為6 393.9 Hz；采樣時(shí)間為2.56 s，采樣次數(shù)為64次；以CD3OD為頻率內(nèi)鎖，并采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列（ZGPR）壓制水峰信號(hào)。

2.2 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)得的1H-NMR信號(hào)導(dǎo)入MestReNova軟件進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換，調(diào)整相位和基線，以TSP（0 ppm）為基準(zhǔn)校正化學(xué)位移。以0.04 ppm為單位對(duì)0.50～8.50 ppm范圍的圖譜進(jìn)行分段積分，并以總峰面積為參照進(jìn)行歸一化處理，得到各化學(xué)位移段與之相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積值，扣除屬于甲醇的信號(hào)（3.28～3.32 ppm）及水峰信號(hào)（4.86～4.94 ppm），用最終得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 供試品溶液的制備

取干燥的烏梅藥材粉末0.2 g，置于錐形瓶中，分別加入1 mL的 CD3OD溶液和 0.3 mL的 D2O溶液（內(nèi)含12.32 mg/mL的KH2PO4和0.04% TSP），混勻，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，取出，濾過(guò)，取0.6 mL 續(xù)濾液至核磁管中，按照上述的1H-NMR條件進(jìn)行測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一烏梅供試品（批號(hào)：WM-1）溶液，在上述1H-NMR條件下連續(xù)測(cè)定5次，依法處理得到積分?jǐn)?shù)據(jù)后，利用Excel軟件計(jì)算5次測(cè)定的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為0.999、0.997、0.998、0.998和0.996，均大于0.9，表明精密度良好[13]。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次烏梅藥材（批號(hào)：WM-1）粉末5份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)行1H-NMR測(cè)定和數(shù)據(jù)處理后，利用Excel軟件計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為0.998、0.995、0.996、0.999和0.997，均大于0.9，表明重復(fù)性良好[13]。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：WM-1）溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、8、12、24 h，分別進(jìn)行1H-NMR測(cè)定和數(shù)據(jù)處理后，利用Excel軟件計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為0.994、0.995、0.998、0.994、0.991和0.992，均大于0.9，表明室溫條件下放置24 h供試品溶液穩(wěn)定[13]。

2.5 烏梅化學(xué)成分的1H-NMR檢測(cè)及信號(hào)歸屬

取同一批次（批號(hào)：WM-1）烏梅藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述波譜條件下進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。采用“加標(biāo)準(zhǔn)品定性”試驗(yàn)進(jìn)行齊墩果酸、綠原酸、酒石酸、熊果酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸等7種成分的1H-NMR信號(hào)歸屬。此外，通過(guò)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)及參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行氨基酸、糖類等成分的1H-NMR信號(hào)歸屬。最終，從烏梅藥材樣品中共鑒定出了19種化合物，包括綠原酸、乳酸、檸檬酸（枸櫞酸）、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、丁二酸、乙酸、丙氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、脂肪酸類和甾醇類等。其中，乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸為首次從烏梅樣品中檢測(cè)到。烏梅藥材代表性的1H-NMR圖譜見(jiàn)圖1[為了清晰地指明各化學(xué)成分的歸屬情況，特以NMR圖譜的高場(chǎng)區(qū)（0.0～2.7 ppm）、中場(chǎng)區(qū)（2.8～4.7 ppm）和低場(chǎng)區(qū)（4.8～8.2 ppm）分別進(jìn)行展示]，19種鑒定化合物的特征信號(hào)化學(xué)位移及多重態(tài)見(jiàn)表2。

2.6 1H-NMR指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取10批烏梅藥材樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述1H-NMR條件進(jìn)樣測(cè)定后，通過(guò)MestReNova軟件比對(duì)各批次藥材的1H-NMR圖譜，確定共有峰，并進(jìn)行信號(hào)歸屬和化學(xué)成分鑒定，最終建立10批烏梅藥材的1H-NMR特征指紋圖譜。以不同批次樣品的積分面積為數(shù)據(jù)，以相關(guān)系數(shù)為測(cè)度，通過(guò)中位數(shù)矢量法計(jì)算得出多個(gè)1H-NMR圖譜的共有模式（對(duì)照?qǐng)D譜R），并以此共有模式為基準(zhǔn)，利用Excel軟件計(jì)算10批烏梅藥材樣品的相似度。結(jié)果，10批烏梅藥材1H-NMR指紋圖譜的相似度均大于0.9，平均相似度為0.974，表明不同來(lái)源烏梅藥材間的總體1H-NMR圖譜相似。其中，樣品WM-2、WM-7、WM-10的相似度相對(duì)較低，提示這3批樣品與其他樣品有一定的差異。10批烏梅藥材的1H-NMR指紋圖譜見(jiàn)圖2，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7 主成分分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同來(lái)源烏梅藥材的質(zhì)量，將不同批次樣品的1H-NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行主成分分析。數(shù)據(jù)采用中心化方法（Mean-centering and not scaling）進(jìn)行尺度同一化處理。結(jié)果，前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為90.3%[第一主成分的貢獻(xiàn)率為73.2%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為17.1%]。樣品WM-1、WM-4、WM-5、WM-6、WM-8聚為一類，表明這5批樣品的化學(xué)成分更加相似；其他批次樣品聚為一類，其中樣品WM-2離中心點(diǎn)最遠(yuǎn)，表明其質(zhì)量差異最大。主成分分析研究結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，表明所建立的1H-NMR指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法可用于烏梅藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。主成分分析的二維得分圖見(jiàn)圖3。

3 討論

目前，基于1H-NMR分析技術(shù)的中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)采用的提取溶劑主要有水、甲醇、含水甲醇、氯仿等[8]，每種溶劑均有其獨(dú)特的提取效果，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)目標(biāo)成分的極性大小選擇最佳的提取溶劑。在前期研究中筆者分別考察了CD3OD-D2O、CD3OD、CDCl3和D2O作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果，以D2O為提取溶劑時(shí)主要提取出了檸檬酸和糖類成分，以CDCl3為提取溶劑時(shí)可提取出更多低極性的脂肪酸類成分，但是兩者對(duì)綠原酸、齊墩果酸等成分的提取效果均不好；以CD3OD和CD3OD-D2O為提取溶劑能夠得到更多的次生代謝產(chǎn)物，但CD3OD對(duì)醋酸、糖類和氨基酸類成分的提取效果又相對(duì)較差。為了盡可能地提取烏梅中多種類型的的化學(xué)成分，故最終選擇以CD3OD和D2O的混合溶劑（1 ∶ 0.3，V/V）進(jìn)行藥材提取。此外，為了防止由于化學(xué)成分濃度差異所引起的化學(xué)位移變化，特加入一定量的KH2PO4緩沖鹽控制樣品溶液的pH值。

烏梅藥材含有多種生物活性成分，如齊墩果酸、熊果酸、檸檬酸等[3]。由于這些成分的極性相差較大，采用HPLC等常規(guī)方法很難通過(guò)單次檢測(cè)就同時(shí)分析出不同類型的化學(xué)成分，不能反映烏梅的整體質(zhì)量和功效價(jià)值。本研究采用體現(xiàn)整體性的1H-NMR分析技術(shù)，首次同時(shí)檢測(cè)并分析了烏梅的整體化學(xué)成分，鑒定了包括五環(huán)三萜類、有機(jī)酸類、糖類等在內(nèi)的19種成分，并首次發(fā)現(xiàn)了烏梅藥材中含有乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸這3種成分。本研究檢測(cè)出的蔗糖、葡萄糖、丙氨酸、抗壞血酸為人體需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；而γ-氨基丁酸具有降血壓、提高免疫力、延緩衰老等生理功能[14]；蘋果酸能有效提高運(yùn)動(dòng)能力，并可抗疲勞和抗氧化[15]；綠原酸具有保護(hù)心腦血管、抗糖尿病及免疫調(diào)節(jié)等作用[16]；齊墩果酸和熊果酸具有改善胰島素抵抗及調(diào)節(jié)血脂等多種生物活性[17]。

本研究結(jié)果表明，1H-NMR分析技術(shù)單次檢測(cè)就能同時(shí)分析烏梅樣品中的有機(jī)酸類、五環(huán)三萜類、糖類等活性成分，反映了烏梅藥材的內(nèi)在質(zhì)量和藥用價(jià)值。本文所建立的1H-NMR方法具有體現(xiàn)整體性、重復(fù)性好、分析快速等優(yōu)點(diǎn)，可為烏梅內(nèi)在質(zhì)量的控制和整體效應(yīng)物質(zhì)的全面檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-05-28 修回日期：2018-08-05）

（編輯：林 靜）