江蕾　李菲　李智　易湘茜　鄧家剛　周桂　高程海

摘要：[目的]研究海黃瓜（Pseudocnus echinatus）共附生細菌多樣性及其發(fā)酵產(chǎn)物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，為甘蔗黑穗病的防治及新型生物農(nóng)藥的研發(fā)提供新途徑。[方法]利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)分離純化海黃瓜的表皮、腸、胃和腸內(nèi)容物等組織的共附生細菌，并通過16S rDNA序列分析共附生細菌種類多樣性及其在海黃瓜不同部位組織的分布特征；采用牛津杯法測定共附生細菌發(fā)酵產(chǎn)物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。[結(jié)果]從海黃瓜各部位組織共分離得到79株共附生細菌，歸屬于4門26科35屬46種；優(yōu)勢菌屬為：芽孢桿菌屬（Bacillus，16.5%）、鞘氨醇盒菌屬（Sphin-gopyxis，8.9%）、小單孢菌屬（Micromonospora，6.3%）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter，6.3%）。分別以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型擔孢子、“-”型擔孢子和菌絲為靶標，采用牛津杯法篩選得到19株活性菌，其中以芽孢桿菌屬的BGMRC03005對甘蔗鞭黑粉菌菌絲、“+”型擔孢子和“-”型擔孢子的抑制作用最強，抑菌圈直徑分別為25.40、19.90和14.25 mm。[結(jié)論]海黃瓜中可培養(yǎng)細菌種類豐富，且富含對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株。篩選獲得的芽孢桿菌屬細菌BGM-RC03005對3種鞭黑粉菌形態(tài)均有抑制作用，具有開發(fā)成為微生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：海黃瓜；海洋細菌；物種多樣性；甘蔗鞭黑粉菌；抑菌活性

中圖分類號：S435.661；Q939.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0488-07

0引言

[研究意義]甘蔗黑穗病是一種由甘蔗鞭黑粉菌（勛orisorium scitamineum）引起的全球性甘蔗病害（V（mky，1999），其傳播速度快，發(fā)病時間短，一旦感染很難根除。鞭黑粉菌侵入甘蔗后，其冬孢子會黏附在幼芽的鱗片內(nèi)部和新生葉的基部，并隨著甘蔗的生長而快速傳播（Su et a1.，2013），從而導致甘蔗產(chǎn)量和產(chǎn)糖量下降。因此，尋找對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的生防菌株，對于甘蔗黑穗病的防治有極其重要的意義。[前人研究進展]生物防治是植物病害防治中的重要組成部分，且越來越得到世界各國的重視，其中，芽孢桿菌因其生長速度快、抑菌作用廣泛而成為科研工作者研究生防微生物的熱點（齊愛勇等，2011）。廖詠梅等（2004）采用微生物純培養(yǎng)法從不同甘蔗黑穗病樣地采集的甘蔗根際土壤及其根、莖、葉等組織內(nèi)分離獲得928株菌株，并采用對峙培養(yǎng)法從中篩選得到18株對甘蔗鞭黑粉菌有較強拮抗作用的細菌菌株，其中有12株隸屬于芽孢桿菌屬。熊國如等（2013）利用對峙培養(yǎng)法測定對甘蔗鞭黑粉菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌的抑菌活性，結(jié)果顯示抑菌圈直徑大于10 mm，且該菌在盆栽防效試驗中對甘蔗黑穗病也有很好的抑制效果。李菲等（2017）利用牛津杯法對來自紅樹植物秋茄的50株內(nèi)生細菌進行抗甘蔗鞭黑粉菌活性測定，結(jié)果篩選得到37株抑制程度不同的活性菌株，其中有6株隸屬于芽孢桿菌屬。[本研究切入點]目前，植物病害生防菌主要是從植物不同部位或其根際土壤中分離獲得，關(guān)于從海生動物中分離篩選得到植物病害生防細菌的研究鮮見報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]以海洋生物海黃瓜（Pseudocnus echinatus）為研究對象，采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)、1 6S rDNA序列分析及牛津杯法開展其共附生細菌多樣性及細菌發(fā)酵產(chǎn)物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用研究，為甘蔗黑穗病的防治及新型生物農(nóng)藥的研發(fā)提供新途徑。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣本來源及預處理 海黃瓜于2016年10月采集自廣西防城港怪石灘（東經(jīng)108°22，北緯21°49）水下5 m。用無菌水沖洗海黃瓜表面3遍，分別從海黃瓜的表皮、腸、胃和腸內(nèi)容物等4個部位切取1 cm×1cmdx塊，分別加1 mL無菌水研磨，研磨液保存于無菌離心管，待用。

1.1.2主要試劑和儀器 培養(yǎng)基、TAE緩沖液、2×Easy Taq MasterMix、引物（27F和1492R）、DNA Mar-ker和GoldView核酸染料購自北京康為世紀生物科技有限公司，Chelex 100樹脂購自美國伯樂公司，其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：SW-CJ-2F型潔凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）、MINI-6k型迷你離心機（常州市國旺儀器制造有限公司）、T-gradient型多功能梯度PCR儀（德國Biometra公司）、Powerpac Basic型電泳儀（美國伯樂公司）、Carestream Gel Logic 2200 Pro冷CCD凝膠成像分析系統(tǒng)（美國銳珂公司）、VCX-500超聲波細胞破碎儀（美國sonics公司）、N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA株式會社）、VB一55型高壓滅菌鍋（德國SYSTEC公司）和MINIB-100型金屬浴（杭州米歐儀器有限公司）。

1.1.3供試菌采集及保存 甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于2017年5月采自廣西金光農(nóng)場的發(fā)病甘蔗植株，輕輕敲打新鮮黑穗病鞭子上的冬孢子，裝于封口袋中，40℃烘干并保存于4℃冰箱備用。

1.2共附生細菌菌株的分離純化

將海黃瓜不同部位組織研磨液分別梯度稀釋至10-1、10。和10-3，將稀釋液涂布至M1、M5、M7、M9、M10、AGG、Isp3和Isp7等8種分離培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)15 d，挑取不同形態(tài)單菌落劃線純化，記錄菌落數(shù)及其形態(tài)特征。用凍存管4℃保藏純化后的菌株。

1.3共附生細菌的多樣性分析

1.3.116S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用Che-lex-100樹脂法（周雙清等，2010）提取純化后細菌的DNA，并參照Walsh等（1991）的方法進行16S rDNA序列的PCR擴增。擴增樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司純化并測序。測序結(jié)果經(jīng)DNASTAR整理，利用EzTaxon Sever 2.1（http：Ilwww.eztaxon.org/）（Kim et a1.，2009）和BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對；選取同源性高的已知序列作為參比菌株，運用MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析（Tamura et a1.，2011）。

1.3.216S rDNA序列聚類分析 參照Tap等（2009）的方法，通過Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，分析海黃瓜不同部位共附生細菌在屬級水平上的分布特征。

1.4共附生細菌對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果試驗

1.4.1細菌粗提物制備 參照覃媚等（2016）的方法，將分離獲得的共附生細菌菌株分別接種于Isp2液體培養(yǎng)基中180 r/min、28℃發(fā)酵7 d，收集發(fā)酵液，用細胞破碎儀進行破碎、乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，收集粗提物，置于干燥器中保存。

1.4.2甘蔗鞭黑粉菌擔孢子及菌絲的制備 參照Singh等（2005）的方法，取少量鞭黑粉菌冬孢子與無菌水混勻，混勻后將原液稀釋至10-1、10-2和10-3，并涂布于PDA培養(yǎng)基上，待其萌發(fā)后，選取生長效果最佳的單菌落（10。時生長效果最佳，最佳濃度選取依據(jù)為涂布后菌落呈單個分布，且稀疏程度適中）與1mL無菌水混勻，稀釋至10^-5，取200μL涂布于PDA培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)3-5 d。待其長出酵母形態(tài)菌落后，隨機選取5個分別接種于YEPS液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h。各取1 uL菌液于PDA培養(yǎng)基上進行隨機交叉配型，若菌落為白色絨毛狀，則兩菌株為異型（+、-）交配型單倍體擔孢子；若菌落為酵母形態(tài)，則兩菌株為同型交配型單倍體擔孢子。

1.4.3抑制甘蔗鞭黑粉菌擔孢子及菌絲生長的活性鑒定 參照宮小明等（2015）的牛津杯法分別檢測各共附生細菌發(fā)酵產(chǎn)物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。利用生物級DMSO將共附生細菌發(fā)酵產(chǎn)物濃度調(diào)至10 mg/mL，分別挑取已驗證的兩種異型（+、-）單倍體擔孢子接種于50 mL YEPS液體培養(yǎng)基中，置于28℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)36 h。參照李菲等（2017）的方法制備待試菌板?？瞻讓φ諡镈MSO，陽性對照為5μg/mL啶酰菌胺。每個牛津杯中加入100μL樣液，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，利用垂直十字交叉法測量各抑菌圈的直徑。

2結(jié)果與分析

2.1海黃瓜中可培養(yǎng)共附生細菌多樣性分析結(jié)果

2.1.116S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用8種分離培養(yǎng)基從海黃瓜的表皮、腸、胃和腸內(nèi)容物中分別分離獲得25、26、8和20株共79株共附生細菌（表1），根據(jù)菌落的表觀形態(tài)及出現(xiàn)時間排除相同菌株，經(jīng)16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，在種的分類水平上，79株共附生細菌可分為46個種，歸屬7：4門26科35屬。從屬級水平統(tǒng)計分離得到的細菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌屬為：芽孢桿菌屬（Bacillus，16.5%）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis，8.9%）、小單孢菌屬（MicFomonospo-ra，6.3%）和檸檬酸桿菌屬（Citroeacter，6.3%）。

根據(jù)46株共附生細菌的16S rDNA序列，選取同源性高的已知序列作為參比菌株，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖1）。如圖1所示，46株共附生細菌與其參比菌株的同源性較高，均在90%以上（圖中未展開表示的4株Bacillus sp.為BGMRC03002-BGMRC03005，其參比菌株分別為B.altitudinis、B.aryabhattai、B.indicus和B.siamen-sis；未展開表示的4株P(guān)seudomonas sp.為BGM-RC03032-BGMRC03035，其參比菌株分別為P.ae-ruginosa、P.monteilii、P.oryzihabitans和P.stutzeri）。

2.1.2各培養(yǎng)基分離海黃瓜中可培養(yǎng)共附生細菌種類 利用8種分離培養(yǎng)基對海黃瓜不同部位中的共附生細菌進行分離純化，結(jié)果（圖2）顯示，Isp7培養(yǎng)基分離得到的細菌種類最多，包括13屬17種細菌；M7培養(yǎng)基分離得到的細菌種類最少，只有2屬4種細菌。菌落計數(shù)結(jié)果表明，M1、M5、M7、M9、MIO、AGG、Isp3和Isp7培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為2.5x 103、3.0× 10³、2.0×10³、2.5×10³、8.0×10³、7.0×10³、6.5×10³和8.5×10³CFU/mL。由此可見，Isp7培養(yǎng)基分離到的菌株數(shù)量及種類均最多，可作為海黃瓜共附生細菌的首選分離培養(yǎng)基。

2.1.316S rDNA序列聚類分析 在屬的分類水平上對海黃瓜表皮、腸、胃和腸內(nèi)容物來源細菌進行16S rDNA序列聚類分析（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)海黃瓜不同部位共附生細菌種類差異較明顯，從海黃瓜表皮、腸、胃和腸內(nèi)容物部位中分別獲得18、18、5和15個菌屬；海黃瓜的4個部位中均分離到芽孢桿菌屬細菌、檸檬酸桿菌屬、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和鞘氨醇盒菌屬的細菌，表皮、腸和腸內(nèi)容物中均分離到分枝桿菌屬（Mycobacterium）和假單胞菌屬（Pseudo-monas）細菌，腸和腸內(nèi)容物中均分離到色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、Fictibacillus屬和小單孢菌屬（Micromonospora）細菌，表皮和腸中均分離到海桿菌屬（Marinobacter）細菌，表皮和腸內(nèi)容物中均分離到海旋菌屬（Thalassospira）細菌。

2.2海黃瓜共附生細菌發(fā)酵物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果

分別以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型擔孢子、“-”型擔孢子和菌絲為靶標，采用牛津杯法從46株細菌中篩選得到8株對鞭黑粉菌菌絲生長有抑制作用的細菌，陽性率為17.4%；9株細菌對鞭黑粉菌“+”型擔孢子有抑制作用，陽性率為19.6%；7株細菌對鞭黑粉菌“-”型擔孢子有抑制作用，陽性率為15.2%（圖4和表2）。46株細菌中有19株對甘蔗鞭黑粉菌至少一種形態(tài)有抑制作用，總陽性率為41.3%，其中芽孢桿菌屬細菌3株，假單胞菌屬細菌2株；在所有活性菌株中，只有細菌BGMRC03005對3種鞭黑粉菌均有抑制作用，且抑制作用最強，抑制甘蔗鞭黑粉菌菌絲、“+”型擔孢子和“-”型擔孢子的抑菌圈直徑分別為25.40、19.90和14.25 mm，其中抑制甘蔗鞭黑粉菌菌絲和“+”型擔孢子的抑菌圈直徑超過陽性對照，具有開發(fā)成為微生物農(nóng)藥的潛力。

3討論

海洋微生物是一種潛在的微生物資源，代謝產(chǎn)物豐富。廣西防城港海域生態(tài)環(huán)境多樣，海產(chǎn)資源豐富，其中富含多種多樣的微生物資源，且活性菌株較多。本研究利用8種成分各異的培養(yǎng)基從廣西防城港怪石灘海域海黃瓜的表皮、胃、腸及腸內(nèi)容物中分離獲得共附生細菌79株，隸屬于4門26科35屬46種，根據(jù)培養(yǎng)基分離出的細菌種類及數(shù)量，確定Isp7培養(yǎng)基為最優(yōu)分離培養(yǎng)基。共附生細菌在海黃瓜各部位的種類與數(shù)量分布不一，其中從腸中分離得到的細菌種類和數(shù)量最多，其次是表皮，胃中最少。海黃瓜中共附生細菌主要分布在腸和表皮上，可能與海黃瓜表皮暴露在海水中，海水中的細菌會附著或寄生在其表皮上，同時海黃瓜在攝食中食物所攜帶的細菌可能會附著或寄生在腸中有關(guān)。

本研究采用牛津杯法從46株共附生細菌中篩選得到19株對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的細菌，總陽性率為41.3%，其中，芽孢桿菌屬細菌BGMRC03005對3種鞭黑粉菌形態(tài)均有抑制作用，與廖詠梅等（2004）、李菲等（2017）的研究結(jié)果相似。芽孢桿菌屬為植物病害生物防治中應用最廣泛且取得成功的一種高效生防微生物（蔣琳和馬承鑄，2000；徐滔明等，2016）。本研究測試了4株分離白海黃瓜的芽孢桿菌（BGMRC03002～BGMRC03005）對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果，結(jié)果顯示有3株芽孢桿菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性，但只有BGMRC03005具有同時抑制3種鞭黑粉菌形態(tài)的活性，其余兩株都僅對某一種形態(tài)的甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用。說明并非所有芽孢桿菌屬的菌株均對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用，且不同種之間抑制效果也不相同，造成不同抑制效果的原因可能與不同種類芽孢桿菌的代謝途徑不同有關(guān)，不同的代謝途徑可能產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)或活性差異明顯的代謝產(chǎn)物。因此，在后續(xù)的研究中還需針對活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物作進一步研究，包括發(fā)酵產(chǎn)物中化學成分分析、活性菌株合成活性產(chǎn)物的途徑及活性產(chǎn)物的作用機理等。

4結(jié)論

本研究采用8種分離培養(yǎng)基對廣西防城港怪石灘海域海黃瓜的表皮、胃、腸和腸內(nèi)容物進行共附生細菌分離及鑒定，結(jié)果共分離獲得共附生細菌79株，歸屬于4門26科35屬46個種，并從中篩選得到19株對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的細菌，表明海黃瓜中可培養(yǎng)細菌種類豐富，且富含對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株，其中芽孢桿菌屬細菌BGMRC03005對3種鞭黑粉菌形態(tài)均有抑制作用，具有開發(fā)成為微生物農(nóng)藥的潛力。

（責任編輯 麻小燕）