番華彩　郭志祥　白亭亭　徐勝濤　楊佩文　尹可鎖　鄭泗軍　潘艷華　李迅東　曾莉

摘要：[目的]明確香蕉棒孢霉葉斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]的生物學(xué)特性，為香蕉棒孢霉葉斑病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。[方法]以采集自云南省香蕉種植區(qū)的香蕉棒孢霉葉斑病病葉片為材料，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌單孢分離，并對病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察及致病性測定；應(yīng)用平板培養(yǎng)法進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性測定。[結(jié)果]香蕉棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長的最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；最適碳源為乳糖和甘露醇，最適氮源為蛋白胨；適宜溫度為25-35℃，最適溫度為28℃；病原菌僅能在pH 6-8內(nèi)生長，最適pH為7；光照處理對菌絲生長有一定影響，以全黑暗條件下病原菌菌絲生長最快。在玉米粉培養(yǎng)基（CMA）上病原菌產(chǎn)孢量最高，光照與黑暗交替有利于產(chǎn)孢。病原菌菌絲致死溫度和時間為58℃處理15 min，分生孢子的致死溫度和時間為51℃處理5 min。[結(jié)論]香蕉棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長溫度范圍較寬，偏好高溫，但適應(yīng)的pH較窄；病原菌產(chǎn)孢的關(guān)鍵因子是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和光照條件。

關(guān)鍵詞：香蕉葉斑?。欢嘀靼翩呔?；生物學(xué)特性；云南省

中圖分類號：S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0481-07

0引言

[研究意義]香蕉棒孢霉葉斑病是云南香蕉產(chǎn)區(qū)的主要葉斑病害之一，該病病原菌為多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]（桑利偉，2007），以溫度高、濕度大的7-9月發(fā)生較嚴(yán)重，受害嚴(yán)重的蕉園病葉發(fā)生率在75%以上，且病害有逐年加重的趨勢，嚴(yán)重影響了香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)。香蕉棒孢霉葉斑病病害癥狀主要表現(xiàn)為：發(fā)病初期，在葉片上形成黃褐色的水浸狀斑點(diǎn)，病斑稍凹陷，后期中央為灰白色的褐色病斑，呈半透明，產(chǎn)生黃色暈圈，葉面上有灰褐色霉層，病斑形狀為橢圓形至圓形，或呈不規(guī)則狀，最后整張葉片干枯、死亡。目前，對香蕉棒孢霉葉斑病的研究主要集中在病害發(fā)生及病原鑒定等方面，尚缺乏針對其病原菌生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究。因此，明確香蕉棒孢霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性，對有針對性地開展病害防治具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]多主棒孢菌最早由魏景超（1982）報道定名。張賀等（2007）報道，多主棒孢菌是一個復(fù)雜的病原菌群體，來源于不同區(qū)域或同一區(qū)域不同寄主間的多主棒孢菌生物學(xué)特性存在差異。該病原菌侵染范圍較廣，侵染力強(qiáng)，能侵染70多種作物（關(guān)國經(jīng)等，2000；李明遠(yuǎn)等，2001；鄒慶道等，2002；張賀等，2007；張麗麗等，2008；羅霓等，2009；陳旭玉等，2012），引起葉斑、莖稈、果實(shí)腐爛等病害癥狀。Blazaquez于1969年報道該病原菌在香蕉上發(fā)生危害；桑利偉（2007）對海南島的香蕉真菌病害進(jìn)行調(diào)查與鑒定時發(fā)現(xiàn)，在海南島有香蕉棒孢霉葉斑病發(fā)生；林善海等（2011）報道在廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)有香蕉棒孢霉葉斑病發(fā)生，并對香蕉棒孢霉葉斑病菌進(jìn)行了分離鑒定。[本研究切入點(diǎn)]目前，關(guān)于香蕉棒孢霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性研究尚無文獻(xiàn)報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]在對云南省香蕉棒孢霉葉斑病病原菌進(jìn)行單孢分離、形態(tài)特征觀察及致病性測定的基礎(chǔ)上，研究在不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH和光照條件下病原菌的生物學(xué)特性，旨在為香蕉棒孢霉葉斑病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)樣采集及病原菌菌株分離

從云南省香蕉種植區(qū)西雙版納州打洛縣采集發(fā)病巴西蕉葉片，取病斑病健交界處組織作為分離材料，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌（方中達(dá)，2001），置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)2 d，純化菌絲2次，待菌絲產(chǎn)孢后用單孢分離法挑取單孢至PDA斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存，供鑒定和生物學(xué)特性測定。

1.2病原菌形態(tài)特征觀察

單孢菌株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上于28℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌菌落形狀、顏色、菌絲疏密程度等。培養(yǎng)15 d后，光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)特征，并測量計算分生孢子大小。

1.3病原菌致病性測定

采用針刺接種法，將病原菌菌絲塊接種于溫室內(nèi)種植的健康巴西蕉葉片（接種7-8張葉片）上，以純PDA培養(yǎng)基接種為對照，重復(fù)4次。接種葉片先用70%酒精進(jìn)行表面消毒，然后用滅菌大頭針將接種部位刺傷，再把PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的病原菌菌餅（直徑為5 mm）接種于刺傷部位，用滅菌濕棉球保濕接種部位48 h，定期觀察病害發(fā)生情況，發(fā)病后，取病健交界處葉片組織分離病原菌，對分離獲得的病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察。

1.4病原菌生物學(xué)特性測定

1.4.1不同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 參照劉秀娟等（1996）、方中達(dá)（2001）的方法配制黑麥瓊脂培養(yǎng)基（MAS）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）、PDA培養(yǎng)基、玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（cA）和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）等6種供試培養(yǎng)基。接種方法：病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用直徑為5mm的滅菌打孔器打取菌齡大小一致的菌絲塊，菌絲塊面向下接種于備用的6種培養(yǎng)基中間，每處理重復(fù)4次。置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7和1 5 d后，分別用十字交叉法測量計算菌落大小，顯微鏡檢測10×10倍下的孢子數(shù)，每處理檢測10個顯微鏡視野，每處理重復(fù)4次。

1.4.2不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 參照肖仲久和李小霞（2013）的方法，測定病原菌菌絲在5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9個溫度下的生長情況，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.3不同pH對病原菌菌絲生長的影響 采用PDA培養(yǎng)基，測定病原菌菌絲在培養(yǎng)基pH 5、6、7、8、9和10等6個梯度（PDA培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60℃左右時，用1 mol/L 0.1%NaOH和HCl溶液調(diào)配滅菌培養(yǎng)基pH）下的生長情況（唐爽爽等，2014），每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.4不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 以剔除碳源后的查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制成含蔗糖、D一麥芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖等5種碳源的固體培養(yǎng)基，對照為不加碳源查氏培養(yǎng)基。測定不同碳源對菌絲生長的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.5不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 以剔除氮源后的查氏（czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制成含蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鈉、磷酸氫二銨和脲等5種氮源的固體培養(yǎng)基，對照為不加氮源查氏培養(yǎng)基。測定不同氮源對病原菌菌絲生長的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.6不同光照條件對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 設(shè)24 h黑暗、24 h光照和12 h黑暗+12 h光照交替等3種光照條件處理，測定不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響，每處理重復(fù)4次，方法同1.4.1。

1.4.7病原菌菌絲致死溫度和時間測定 綜合參照張賀等（2007）、孫志峰等（2008）、楊永利等（2015）的方法，病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，無菌環(huán)境下分別用100 mL無菌水將每個培養(yǎng)基中的菌絲制成菌懸液，各取10 mL菌懸液裝入滅菌試管并塞上試管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒溫水浴鍋中分別水浴處理5、10和15 min，水浴過程中緩慢搖動試管。處理結(jié)束后降至室溫，用移液槍取0.2 mL不同處理的菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察培養(yǎng)基上有無菌落生長，以未經(jīng)過溫度處理的菌懸液為對照，每處理重復(fù)4次。

1.4.8病原菌分生孢子致死溫度和時間測定 病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，于10×10倍顯微鏡下配制濃度為每個視野10～15個孢子的懸浮液，取10 mL分生孢子懸浮液裝入滅菌試管并塞上試管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒溫水浴鍋中分別處理5、10和15 min，水浴過程中緩慢搖動試管，浴后立即取出降至室溫（張賀等，2007；孫志峰等，2008；楊永利等，2015），用移液槍取0.2 mL不同處理的菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察培養(yǎng)基上有無菌落生長，以未經(jīng)過溫度處理的孢子懸浮液為對照，每處理重復(fù)4次。

1.5統(tǒng)計分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌形態(tài)特征描述

在PDA培養(yǎng)基上，病原菌菌落疏展，灰色至灰褐色，呈毛發(fā)狀或細(xì)絨毛狀，氣生菌絲茂盛，菌落中央顏色較邊緣深并隆起（圖1-A），菌落背面中央呈黑褐色（圖1-B）。分生孢子梗單生或數(shù)根叢生，直立或彎曲，不分枝，褐色，光滑，具1-7個隔膜。菌絲有分隔，淺褐色，有隔膜。分生孢子頂生、單生，淺褐色，棍棒狀至圓筒形，直或稍彎，頂端漸尖細(xì)，基部平切具孢臍，大小（30-220）gmx（10-20）um（圖1-C）。結(jié)合其菌落特征及戚佩坤（2000）、林善海等（2011）關(guān)于該菌的特征描述，鑒定該菌為多主棒孢菌[C. cas-siicola（Berk&Curt）Wei]。

2.2病原菌致病性測定結(jié)果

接種病原菌3 d后開始巴西蕉葉片表現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種部位呈黃褐色水浸狀斑點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展成圓形至橢圓形褐色病斑，周圍有黃色暈圈，中央灰白色、半透明，后期病部可見灰黑色霉層（圖2-A）。接種病原菌后的表現(xiàn)癥狀與大田自然發(fā)生癥狀（圖2-B）相似，并從接種發(fā)病病斑組織病健交界處能再次分離到與供試病原菌菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)一致的菌株，對照葉片無發(fā)病癥狀。

2.3病原菌生物學(xué)特性測定結(jié)果

2.3.1不同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 由圖3可知，病原菌在供試6種培養(yǎng)基上均能較好地生長，其中最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其次是MAS培養(yǎng)基，二者的菌落直徑顯著大于其他培養(yǎng)基上的菌落直徑（P<0.05，下同），隨后是OA和PSA培養(yǎng)基，但在OA培養(yǎng)基上病原菌菌絲稀疏、顏色淺，在CMA和CA培養(yǎng)基上病原菌生長速度稍慢。培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量影響亦較大，其中產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基，其產(chǎn)孢量顯著多于其他培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，其次為CA培養(yǎng)基，在OA、MAS、PSA和PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢均較少。

2.3.2不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，溫度對病原菌菌絲生長有顯著影響，10～40℃下病原菌均能長出菌絲，但生長差異明顯，25～35℃時病原菌菌絲生長良好，其中在28℃下菌落直徑最大，顯著大于其他溫度（30℃除外）條件下的菌落直徑，28℃為菌絲的最適生長溫度。

2.3.3不同pH對病原菌菌絲生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，不同pH對病原菌菌絲生長影響較大，菌絲僅在pH 6～8能生長，最適為pH 7。

2.3.4不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，病原菌菌絲在乳糖和甘露醇培養(yǎng)基上生長最快，二者的菌落直徑顯著大于其他碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑，其次為D一麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，在無碳源的培養(yǎng)基上病原菌雖然可以生長，但菌絲較稀疏、顏色較淺。

2.3.5不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，病原菌菌絲在蛋白胨培養(yǎng)基上生長最快，其菌落直徑顯著大于其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑，其次為酵母浸粉、磷酸氫二銨和硝酸鈉，在無氮源的培養(yǎng)基上病原菌雖然可以生長，但菌絲較稀疏、顏色較淺。

2.3.6不同光照條件對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 3種光照條件對病原菌菌絲生長有一定影響，以全黑暗條件下病原菌菌絲生長最快，其菌落直徑顯著大于其他2種光照條件下的菌落直徑；全光照和12 h光暗交替處理對病原菌菌絲生長的影響不明顯。不同光照處理對病原菌產(chǎn)孢有顯著影響，12 h黑暗+12 h光照交替條件下有利于病原菌產(chǎn)孢，在此光照條件下的產(chǎn)孢量顯著多于其他2種光照條件下的產(chǎn)孢量，全黑暗和全光照條件下的產(chǎn)孢量較少。

2.3.7病原菌菌絲的致死溫度和時間 病原菌菌絲在7個不同溫度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分別處理5、10和15 min后，發(fā)現(xiàn)40～55℃各處理的病原菌菌絲均能生長，60～70℃各處理的病原菌菌絲均不能生長；經(jīng)過56、57、58和59℃等4個溫度下分別處理5、10和15 min后，56和57℃各處理的病原菌菌絲均能生長，58℃處理15 min及59℃各處理的病原菌菌絲均不能生長，表明病原菌菌絲的致死溫度和時間為58℃處理15 min。

2.3.8病原菌分生孢子的致死溫度和時間 病原菌分生孢子懸浮液在7個不同溫度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分別處理5、10和15 min）～，發(fā)現(xiàn)40～50℃各處理的病原菌分生孢子懸浮液在PDA培養(yǎng)基上均能形成新的菌落，55～70℃各處理的病原菌分生孢子懸浮液在PDA培養(yǎng)基上均不能形成新的菌落；經(jīng)過51、52、53和54℃等4個溫度下分別處理5、10和15 min后，各處理在PDA培養(yǎng)基上均不能形成新的菌落，表明病原菌分生孢子的致死溫度和時間為51℃處理5 min。

3討論

本研究中，香蕉多主棒孢菌菌絲在10～40℃均能生長，適宜溫度為25～35℃，最適溫度為28℃，與云南香蕉棒孢霉葉斑病于7～9月溫度高、濕度大的季節(jié)集中發(fā)生流行的規(guī)律一致。與黃瓜（劉鳴滔，2005；吳橋，2017）、橡膠樹（張賀等，2007；張春霞等，2010）、番木瓜（羅霓等，2009）、廣藿香（陳旭玉等，2012）、甜瓜（王爽等，2013）和蔬菜（楊苗，2013）等來源不同或相同地區(qū)的不同寄主的多主棒孢菌相比，香蕉多主棒孢菌適應(yīng)生長的溫度范圍廣，適宜生長的溫度高，與楊苗（2013）發(fā)現(xiàn)的多主棒孢菌對不同溫度的敏感性與寄主來源密切相關(guān)、與地理來源不相關(guān)的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，病原菌菌絲的致死溫度和時間為58℃處理15 min，分生孢子的致死溫度和時間為51℃處理5 min，與張賀等（2007）報道的橡膠多主棒孢菌菌絲致死溫度和時間為60℃處理15 min，分生孢子致死溫度和時間為55℃處理5 min，以及關(guān)國經(jīng)等（2006）報道的烤煙多主棒孢菌分生孢子致死溫度和時間為55℃處理10 min均有差異，可能與不同的寄主及來源有關(guān)。

在3種光照條件下香蕉多主棒孢菌菌絲生長均良好，全黑暗條件下病原菌菌絲生長最快，全光照和12 h光暗交替處理對菌絲生長無顯著影響，12 h光暗交替有利于病原菌產(chǎn)孢，說明該病原菌產(chǎn)孢量對光照敏感，與鄒慶道等（2002）、張賀等（2007）的報道一致，但與羅霓等（2009）、陳旭玉等（2012）的研究結(jié)果存在差異。

香蕉多主棒孢菌對pH較敏感，菌絲僅在接近中性（pH 6-8）的條件下生長，最適pH為7。而黃瓜（劉鳴滔，2005）、橡膠樹（張賀等，2007；張春霞等，2010）、番木瓜（羅霓等，2009）和廣藿香（陳旭玉等，2012）的多主棒孢菌對pH適應(yīng)范圍較廣，在pH 3-11范圍內(nèi)均能生長。本研究中的多主棒孢菌系首次分離自云南蕉園中，通過研究發(fā)現(xiàn)，香蕉棒孢霉葉斑病病原菌與不同寄主作物來源的多主棒孢菌菌株問的生物學(xué)特性存在明顯差異，可能與菌株遺傳或生理性差異等有關(guān)，具體原因需對病原菌開展進(jìn)一步研究。香蕉棒孢霉葉斑病是云南香蕉產(chǎn)區(qū)的主要葉斑病之一，對云南香蕉產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，今后應(yīng)加強(qiáng)對該病害的防控研究，以控制其發(fā)生危害。

4結(jié)論

香蕉棒孢霉葉斑病病原菌與不同寄主作物來源的多主棒孢菌菌株間的生物學(xué)特性存在明顯差異，該病原菌菌絲生長溫度范圍較寬，偏好高溫，但適應(yīng)的pH較窄，病原菌菌絲僅在接近中性的條件下生長；病原菌產(chǎn)孢的關(guān)鍵因子是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和光照條件。

（責(zé)任編輯 麻小燕）