李文

摘要：為避免蔬菜殘留農(nóng)藥理化檢測(cè)中耗時(shí)長(zhǎng)、污染環(huán)境等不足，研究了蔬菜基質(zhì)對(duì)光譜檢測(cè)乙酰甲胺磷的影響，建立了一種直接檢測(cè)蔬菜中殘留農(nóng)藥的方法。選用白菜、芹菜提取液和去離子水分別配制3組農(nóng)藥樣品，與乙酸氯化鈀溶液進(jìn)行比色反應(yīng)，對(duì)比分析300～900nm波段的吸收光譜和建立的偏最小二乘回歸（PLSR）模型。結(jié)果表明，兩種基質(zhì)均可改變農(nóng)藥樣品的特征波長(zhǎng)，降低樣品吸光值的區(qū)分度，使PLSR模型預(yù)測(cè)精度明顯降低。改用差示分光光度法后，加入白菜、芹菜兩種基質(zhì)后的PLSR模型驗(yàn)證集的決定系數(shù)從0.90、0.92均提高到0.95，均方根誤差分別從10.64和9.89下降到7.64和6.98。說(shuō)明采用差示分光光度法與PLSR模型相結(jié)合，可建立簡(jiǎn)單易行的蔬菜殘留農(nóng)藥快速定量檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：基質(zhì);差示分光光度法; 比色光譜;農(nóng)藥殘留

中圖分類號(hào)：X836

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018） 05-1169-05

近年來(lái)，農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題日益突出，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。為了有效保證蔬菜的食用安全，研究人員試驗(yàn)了多種檢測(cè)技術(shù)和手段。但是由于蔬菜品種繁多，所含成分比較復(fù)雜，在樣品前處理過程中，需要添加多種溶劑以去除蔬菜中影響被測(cè)農(nóng)藥的成分，凈化步驟非常繁瑣。黃雙根等采用無(wú)水硫酸鎂、Ⅳ一丙基乙二胺、石墨化炭黑和C18去除蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)的影響，模擬農(nóng)藥殘留狀態(tài)，利用拉曼光譜檢測(cè)白菜中的馬拉硫磷。熊俊飛等用類似方法去除芹菜中的影響成分，檢測(cè)苯醚甲環(huán)唑。這些方法不僅容易對(duì)環(huán)境造成二次污染，而且不易保證提取純度。相關(guān)研究結(jié)果證明，蔬菜的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)常用的氣相色譜一質(zhì)譜法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的影響不容忽視。此外，固相萃取、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等多種方法被應(yīng)用在樣品前處理中，但是仍然存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。

為了避免上述樣品前處理和檢測(cè)過程中的種種弊端，光譜技術(shù)被用于對(duì)含有蔬菜基質(zhì)的農(nóng)藥直接進(jìn)行快速定量檢測(cè)的研究。鑒于目前研究蔬菜基質(zhì)在紫外一可見光波段對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)影響的相關(guān)報(bào)告較少，本研究選用白菜和芹菜作為基質(zhì)，結(jié)合前期的研究成果，在氯化鈀比色法基礎(chǔ)上，以乙酰甲胺磷為例，進(jìn)一步研究?jī)煞N蔬菜基質(zhì)對(duì)含硫基類有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40%乳油乙酰甲胺磷，北京嘉禾種業(yè)有限公司產(chǎn)品;氯化鈀結(jié)晶粉末、乙醇（分析純）、冰乙酸（分析純）、去離子水，北京藍(lán)弋化工公司產(chǎn)品;無(wú)公害新鮮白菜、芹菜購(gòu)自北京超市綠色蔬菜專賣區(qū)。

1.2 蔬菜基質(zhì)制備

將白菜、芹菜菜葉用去離子水洗凈，晾干，切碎，榨汁，勻漿。以體積比1∶1加入無(wú)水乙醇，攪拌，振蕩，提取上清液，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液待用。

1.3 比色劑配制

稱取氯化鈀晶體1.0g，加入冰乙酸15ml，攪拌5 min，加去離子水稀釋到200ml，配制成0.5%的氯化鈀乙酸溶液，水浴45℃下密封放置30 min。

1.4 樣品制備

分別用去離子水、白菜和芹菜提取液配制3組乙酰甲胺磷溶液，每組包括46個(gè)不同農(nóng)藥質(zhì)量濃度的樣品，質(zhì)量濃度范圍是0.5～90.0mg/L，每個(gè)樣品溶液體積為5ml。

1.5 測(cè)量方法

向每個(gè)樣品中滴入比色劑2ml，混勻，靜置2min后，以比色劑為參比液，使用UV-2450分光光度計(jì)在300～900 nm采集每個(gè)樣品的吸收光譜。此外，不改變參比液，分別采集白菜和芹菜基質(zhì)的吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜和芹菜基質(zhì)對(duì)乙酰甲胺磷樣品光譜特征的影響

由乙酰甲胺磷樣品的吸收光譜圖（圖1）可以看出，相對(duì)吸光值與乙酰甲胺磷質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，且在300～360 nm的紫外波段嚴(yán)重失真。但是，與不含蔬菜基質(zhì)的對(duì)照相比，含有白菜和芹菜基質(zhì)的乙酰甲胺磷樣品光譜在可見光波段發(fā)生明顯改變：①白菜和芹菜基質(zhì)使被測(cè)農(nóng)藥在340～440nm波段吸光值的區(qū)分度明顯減小，在430 nm處的特征峰消失;②兩種基質(zhì)使各樣品在360～900nm波段的吸光值增大，且白菜基質(zhì)的效果更明顯。因此，兩種蔬菜基質(zhì)對(duì)乙酰甲胺磷比色光譜產(chǎn)生的影響不可忽視。

2.2 白菜和芹菜基質(zhì)的光譜特征

白菜和芹菜基質(zhì)的吸光譜圖（圖2）顯示，兩種基質(zhì)均在300～330nm的紫外波段受到較大干擾，在340～380nm波段同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)吸光值約為l的特征峰，在380～440nm波段吸光值最低且保持不變。在340～900nm波段白菜基質(zhì)的吸光度大于芹菜基質(zhì)的吸光度，二者的吸光值分別在500nm和600 nm處由負(fù)變正，且分別在690nm和680nm處出現(xiàn)一個(gè)較小的特征峰。

對(duì)比圖1和圖2.分析兩種基質(zhì)對(duì)乙酰甲胺磷樣品比色光譜產(chǎn)生影響的原因。由于提取的白菜和芹菜基質(zhì)分別呈現(xiàn)淺黃色和淡綠色，二者的互補(bǔ)色均為紫色，而紫色的吸收光譜在380～440nm，因此兩種基質(zhì)的相對(duì)吸光度在該波段近似相等（約為-2）。此外，蔬菜提取液顏色對(duì)比色產(chǎn)物（黃色絡(luò)合物硫化鈀）顏色的影響，使得相應(yīng)吸光度的變化量更微弱，所以含有白菜和芹菜基質(zhì)的乙酰甲胺磷樣品吸光值在該波段的區(qū)分度明顯降低（圖1）。被測(cè)樣品的光譜形狀在380～440nm波段改變最大，表明兩種蔬菜基質(zhì)的顏色是影響該波段比色光譜的主要原因。而在340～380nm、440～900nm波段白菜基質(zhì)吸光值較高的原因可能是由于兩種基質(zhì)所含成分的不同引起的。

2.3 基質(zhì)對(duì)吸光值與樣品質(zhì)量濃度之間相關(guān)性的影響

利用SG（Savitzky-Golay）卷積平滑高頻噪聲提高信噪比，計(jì)算3組光譜數(shù)據(jù)各波長(zhǎng)處吸光值和樣品質(zhì)量濃度之間的相關(guān)系數(shù)。由圖3可以看出，未加基質(zhì)時(shí)，在可見光波段相關(guān)系數(shù)均大于0.在480nm處相關(guān)系數(shù)達(dá)到最大值（0.95）;加入白菜基質(zhì)后，相關(guān)系數(shù)在700—900 nm波段降為負(fù)值，在498nm處相關(guān)系數(shù)最大（0.80）：加入芹菜基質(zhì)后，在681nm處相關(guān)系數(shù)最大（0.86），且在500～900nm波段相關(guān)系數(shù)變化較小。表明兩種基質(zhì)不僅改變了吸收光譜的特征波長(zhǎng)，而且對(duì)部分波段吸光值與樣品質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)的影響也非常顯著。

2.4 乙酰甲胺磷檢測(cè)的PLSR模型

由于3組光譜數(shù)據(jù)都存在多重共線性，若用全波段數(shù)據(jù)建立預(yù)測(cè)模型，不僅計(jì)算量大而且模型的穩(wěn)定性較差。偏最小二乘回歸（PLSR）不僅可以有效去除共線性，還可以提取主要的有效成分作為建模輸入信息。因此，根據(jù)最大相關(guān)系數(shù)原理，分別以3組數(shù)據(jù)各自的特征波長(zhǎng)為中心，依次選擇不同的特征波段建立PLSR模型。5一折交叉驗(yàn)證中，取驗(yàn)證集的決定系數(shù)（R2）和均方根誤差RMSEP的10次平均值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

對(duì)比效果（表1）顯示，3組數(shù)據(jù)的特征波段都在可見光范圍，未加基質(zhì)樣品的PLSR模型檢測(cè)效果比較理想。由于基質(zhì)的顏色及所含成分引起被測(cè)農(nóng)藥譜線的區(qū)分度降低，各波長(zhǎng)處吸光值與樣品質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)總體降低，使其PLSR模型的檢測(cè)精度降低。加入芹菜基質(zhì)后在540～740nm波段吸光值與樣品質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)相對(duì)較高，其PLSR模型的檢測(cè)精度比加入白菜基質(zhì)的好，但與未加入基質(zhì)的樣品相比，預(yù)測(cè)精度仍然較低。因此，有必要進(jìn)一步提高蔬菜基質(zhì)中被測(cè)農(nóng)藥的預(yù)測(cè)精度。

2.5 差示光度法對(duì)乙酰甲胺磷檢測(cè)PLSR模型精度的影響

加入白菜和芹菜基質(zhì)后PLSR模型精度低的主要原因是吸光值的區(qū)分度減小，而且被測(cè)樣品的質(zhì)量濃度變化范圍（0.5～90.0mg/L）可能超出朗伯一比爾定律的線性范圍，導(dǎo)致較高質(zhì)量濃度段和較低質(zhì)量濃度段樣品的檢測(cè)誤差較大。為此，采用差示光度法，將參比溶液更換為一定質(zhì)量濃度的被測(cè)溶液，對(duì)高、低質(zhì)量濃度段的樣品分別采用高吸光度差示法和低吸光度差示法以提高光譜的采集精度。對(duì)高質(zhì)量濃度樣品，用質(zhì)量濃度比被測(cè)溶液稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，調(diào)節(jié)分光光度計(jì)透光率T=100%，再測(cè)定樣品濃度Cx，如果得到T= 50.0%，二者之差為50%，相當(dāng)于把標(biāo)尺擴(kuò)大了10倍，測(cè)量讀數(shù)的相對(duì)誤差也就縮小了10倍。根據(jù)朗伯一比爾定律，差示法的公式表達(dá)為：△A=k（Ck-Cx）L，式中△A為相對(duì)吸光度，k為入射光的吸收系數(shù)，Cs和Cx分別為被測(cè)溶液和參比溶液的濃度，L為光程。上式表明，在符合朗伯一比爾定律測(cè)定濃度范圍內(nèi)，示差法測(cè)得的相對(duì)吸光度（△A）與被測(cè)溶液和參比溶液的濃度差（Cs-Cx）成正比，可用于定量測(cè)定。此時(shí)溶液的△T= 50%，讀數(shù)在適宜的范圍內(nèi)，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確度。同樣道理，測(cè)定低質(zhì)量濃度樣品時(shí)，用濃度比樣品溶液稍高的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，調(diào)節(jié)光度計(jì)的透光率為0。

經(jīng)過比較大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終確定白菜和芹菜基質(zhì)的PLSR模型預(yù)測(cè)精度（表1）。在建模波段和主成分?jǐn)?shù)量相同的情況下，兩種基質(zhì)下模型驗(yàn)證集決定系數(shù)分別從0.90、0.92提高到0.95，RMSEP分別從10.64、9.89下降到7.64和6.98，證明示差法可以有效減小基質(zhì)對(duì)殘留農(nóng)藥檢測(cè)的影響，實(shí)現(xiàn)直接定量檢測(cè)蔬菜殘留農(nóng)藥的目標(biāo)。

3 結(jié)論

本研究將比色法、差示光度法和PLSR建模相結(jié)合，通過分析白菜和芹菜提取液作為基質(zhì)對(duì)乙酰甲胺磷檢測(cè)的影響，建立了一種直接檢測(cè)蔬菜基質(zhì)中農(nóng)藥的快速方法。該方法簡(jiǎn)化了樣品前處理過程，避免了使用大量溶劑提取被測(cè)農(nóng)藥的繁瑣步驟。得到以下結(jié)論：（1）白菜和芹菜基質(zhì)對(duì)乙酰甲胺磷比色光譜的影響因素主要是基質(zhì)的顏色和成分?；|(zhì)顏色的影響主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一是基質(zhì)顏色本身的吸收光譜改變了被測(cè)樣品的紫色波段（約380～440nm）譜線形狀，使該波段不能作為PLSR建模波段：二是基質(zhì)顏色對(duì)比色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色形成干擾，使樣品吸光值的區(qū)分度減小，降低了PLSR模型的預(yù)測(cè)精度。基質(zhì)成分的影響主要使樣品各波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光值增大，對(duì)PLSR模型精度的影響較小。（2）常規(guī)數(shù)據(jù)預(yù)處理無(wú)法消除基質(zhì)的影響以提高PLSR模型精度。通過改用吸光度差示法采集吸收光譜，PLSR模型預(yù)測(cè)精度明顯提高，加入白菜和芹菜基質(zhì)的驗(yàn)證集的決定系數(shù)均達(dá)到0.95，均方根誤差分別下降到7.64和6.98，可以直接定量檢測(cè)蔬菜基質(zhì)中的農(nóng)藥含量。（3）由于本研究的比色原理是氯化鈀在酸性環(huán)境下和含硫基的化合物反應(yīng)形成黃色絡(luò)合物硫化鈀，因此這一方法也適用于其他常見的含硫基類農(nóng)藥如樂果、毒死蜱等。通過進(jìn)一步研究更多蔬菜基質(zhì)對(duì)含硫基類農(nóng)藥檢測(cè)的影響，建立統(tǒng)一的蔬菜農(nóng)殘快速檢測(cè)方法，可為研發(fā)實(shí)用的農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀器提供有益參考。