劉媛 劉敏 張霄 徐重新 林曼曼 胡曉丹 仲建鋒 謝雅晶 羅楚平 張存政 劉賢金
摘要:為了降低蘇云金桿菌Cry2A毒素的免疫檢測成本,開發(fā)廉價、無毒試劑盒,采用整體抗體免疫和噬菌體展示技術的路線,設計和構建了Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫。以Protein A純化的Cry2A兔多克隆抗體為免疫原,對雌性Balb/e系小鼠進行了免疫。在優(yōu)化的包被原濃度下,用ELISA法測定小鼠血清效價及抗獨特型抗體組分。選取效價最高的小鼠,取脾臟提取總RNA,RT-PCR法合成cDNA第一鏈。設計簡并引物,利用PCR法擴增小鼠VH、VK基因,再用SOE-PCR法進行單鏈抗體基因的拼接。SOE-PCR產(chǎn)物和pIT2載體經(jīng)雙酶切后連接,電轉入感受態(tài)E.Coli、TG1完成建庫,并用多克隆噬菌體ELISA對抗體庫與免疫原的結合能力進行了鑒定。結果表明,免疫鼠血清的效價在1:1.6xl05到1:6.4x l05倍之間。免疫鼠血清可對Cry2A與其兔多克隆抗體的結合最高可產(chǎn)生17. 6%的抑制,證明Ab2B和Ab2y型抗獨特型抗體的存在。最終構建了庫容為1.2xl07的Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫,該抗體庫與免疫原的結合信號/背景比值為6. 04。
關鍵詞:Cry2A毒素;抗獨特型抗體;單鏈抗體;噬菌體展示
中圖分類號:X836
文獻標識碼: A
文章編號: 1000-4440(2018) 05-1174-09
蘇云金桿菌Cry毒素是全球應用最為成功的殺蟲蛋白資源,對多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲存在毒性,也對線形動物門和原生動物門的某些種類存在毒性。隨著轉Cry毒素基因作物的廣泛種植和在農(nóng)藥制劑中的大量使用Cry毒素,Cry毒素可能存在的生態(tài)安全風險和對非靶標生物的安全隱患也廣受關注。為加強轉基因作物監(jiān)管,保障消費者的知情權,國內(nèi)外各實驗室也陸續(xù)開展了Cry毒素檢測方法的研。其中免疫學檢測以其檢測靈敏度高、檢測通量大等優(yōu)勢成為一種主流的檢測方法。Cry毒素標準品作為免疫學檢測的必備試劑,目前主要由美國Envirologix公司提供,價格較高,這導致Cry毒素免疫學檢測成本的增加。因此,有必要尋找Cry毒素的廉價、無毒、安全替代蛋白質,創(chuàng)制具有自主知識產(chǎn)權的生物制劑。
抗獨特型抗體作為一種有效的生物模擬材料,可以模擬多種毒素的特征表位,作為毒素標準品的替代物應用于免疫檢測試劑盒以降低檢測成本,而且不具毒性。目前已在黃曲霉毒素、微囊藻毒素、嘔吐毒素、富馬毒素、T2毒素等生物毒素的抗獨特型抗體制備和應用中取得成功。但是抗獨特型抗體技術的發(fā)展也存在一些制約因素,其中之一是抗獨特型抗體的制備難度大。以抗獨特型抗體制備的主流方法單克隆抗體技術為例,首先是抗獨特型抗體的陽性克隆率低,一般制備成功率是常規(guī)抗體的幾百分之一。其次,抗體分離純化困難。由于抗獨特型抗體形成過程中,同時產(chǎn)生針對不同決定簇的α、β、y、δ4種類型抗獨特型抗體,要篩選獲得建立檢測技術所需的β或γ型,難度較大。20世紀90年代興起的抗體庫技術,為抗獨特型抗體的制備提供了新契機。但是由于從天然抗體庫中篩選獲得抗獨特型抗體的幾率較低且親和力不高,因此先通過動物免疫增加抗獨特型抗體豐度,再構建免疫抗體庫用于篩選,可以大大增加篩選陽性率和抗體的親和力。
雖然Cry毒素存在較大的檢測需求,但是國內(nèi)外尚無Cry毒素抗獨特型單鏈抗體庫構建的報道。本研究擬聯(lián)合采用整體抗體免疫和噬菌體展示的技術路線,構建Cry2A毒素抗獨特型單鏈抗體庫,為其獨特型單鏈抗體的篩選和無毒檢測試劑盒的構建奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
Cry2A多抗血清由本實驗室免疫新西蘭大白兔自制獲得。HiTrap Protein A HP柱、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗M13單抗購自美國GE Health-care公司。BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自美國Sigma公司。6~8周齡雌性BALB/c系小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學研究中心。Cry2A毒素標準品購自美國Envirologix公司。TR-Izol購自美國Thermo Fisher公司。SuperScriptTMⅢ試劑盒購自美國Invitrogen公司。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Nco I和NotI、輔助噬菌體M13K07購自美國NEB公司。2xtaq PCR master mix和2xpfuPCR master mix分別購自德國DBI公司和東盛生物有限公司。半合成人源Tomlinson I庫、含有牛血清白蛋白(BSA)單鏈抗體基因的pIT2載體、E.Coli.TG1購自英國Source Bioscience有限公司。HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG購自美國KPL公司。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、96孔酶標板購自美國Coming公司。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自美國Sigma公司。脫脂奶粉購自索萊寶生物科技有限公司。試驗所用其他化學試劑及有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 Cry2A兔多克隆抗體的純化與鑒定
參照HiTrap Protein A HP說明書,將實驗室自制的Cry2A兔多抗血清進行親和純化。純化抗體用SDS-PAGE檢測純度,銀染顯色。并以BSA為參照蛋白質,用蛋白質定量試劑盒測定純化抗體濃度,分裝后于-80℃保存。
1.3 動物免疫
以Protein A柱純化的Cry2A兔多克隆抗體作為免疫原,免疫3只6~8周齡雌性Balb/c系小鼠,免疫前l(fā)周采集陰性血清。具體免疫程序如下:首免采用每只100μg/ml用50 mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解的免疫原與等體積弗氏完全佐劑混和,乳化成油包水結構后進行腹腔注射。14 d后用同樣劑量的免疫原與等體積不完全弗氏佐劑混合乳化后進行加強免疫。此后每隔14 d加強免疫1次。共計免疫4次。從第2次加強免疫開始,每次免疫后7d,斷尾取血,制備鼠抗血清,用于效價監(jiān)測。
1.4 包被原工作濃度優(yōu)化、抗血清效價及抗獨特型抗體組分的測定
用間接非競爭ELISA法優(yōu)化包被原濃度并測定小鼠抗血清效價。具體步驟如下:(1)包被:用50mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)對Cry2A兔多抗血清從100倍開始進行5倍稀釋,每孔100μl加入96孔酶標板,4℃包被過夜。(2)封閉:含0.05% Tween 20的PBS緩沖液(PBST)洗板3次后,每孔200μl加入PBS溶解的2%脫脂奶粉(MPBS),37℃孵育th。(3)加樣:PBST洗板3次后,將最后一次采血得到的l號鼠抗血清和對應的陰性血清,用PBS稀釋10000倍,每孔100μl加入酶標板,37℃孵育th。(4)加酶標二抗:PBST洗板3次后,每孔100μl加入5000倍PBS稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG,37℃孵育lh。(5)顯色:PBST洗板3次后,每孔100μl加入現(xiàn)配的底物溶液(100μl 10mg/ml=甲亞砜溶解的TMB和25μ1 0.65%H202溶于9.875ml 100 mmol/L pH 5.5的檸檬酸緩沖液),37℃顯色15min。(6)終止反應:每孔50μl加入2mol/L H2S04,用酶標儀在450nm波長下讀數(shù)。小鼠抗血清效價測定在優(yōu)化的包被原濃度下進行,具體操作同包被原優(yōu)化方法,以吸光值大于陰性孔2.1倍時的鼠抗血清的最大稀釋倍數(shù)作為效價。
采用間接競爭ELISA法測定鼠抗血清中抗獨特型組分。具體操作同包被原優(yōu)化方法,但在以下操作中有改動:(1)包被:用2μg/ml Cry2A毒素包被酶標板。(2)加樣:每孔加入50μl 250—16000倍PBS稀釋的最后一次采血得到的l號鼠抗血清與50μ1 10000倍稀釋的Cry2A兔多抗血清,另外以同樣稀釋倍數(shù)的鼠陰性血清與Cry2A兔多抗血清混合,作為陰性對照。(3)二抗:加入5000倍PBS稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG。其余ELISA步驟同包被原優(yōu)化方法。
1.5 鼠抗體VH和VK基因的擴增和拼接
l號小鼠拉頸處死后取脾臟,參照TRIzol試劑說明書提取總RNA。再采用SuperScriptTMⅢ試劑盒將RNA反轉錄為cDNA第一鏈。參考Clackson等和Orlandi等的報道,設計VH和VK擴增引物(表1)。以cDNA第一鏈為模板,用VHIBACK-Ncol和VHIFOR-2為引物擴增VH基因,以Vk2BACK 和 Vk4FOR-Not I(Vk4FORl-Not I、Vk4FOR2-Not I、Vk4FOR3-Not I、Vk4FOR4-Not I等比例混合)為引物擴增VK基因,反應體系在lxPFUPCR master mix中進行。Linker則以pSW2scDl.3基因為模板,LINKBACK和LINKFOR為引物,lxPFUPCR master mix中進行擴增。PCR反應條件均為94℃5min;94℃ 45s,55℃45s,72℃1min,30個循環(huán),72℃ 10 min。產(chǎn)物膠回收后用于下一步scFv基因的拼接。
參考Pasello等的方法進行scFv基因拼接。具體為取等摩爾的VH、VK和Linker基因混合后,在lxtaq PCR master mix體系中,進行第一步SOE-PCR,PCR反應條件為94℃1 min,65℃1mm,72℃ lmin,30個循環(huán),72℃ 7min。第一步拼接產(chǎn)物用無菌水稀釋1000倍后,加入含有引物VHIBACK-Ncol和Vk4FORl-Notl的lxtaq PCR master mix體系。PCR條件設置為94℃ 40s,55℃40 s,72℃2min,5個循環(huán):94℃ 40 s,50℃40s,72℃ 2 min,5個循環(huán);94℃ 40 s,45℃ 40 s,72℃2 mm,5個循環(huán):94℃40 s,40℃ 40 s,72℃ 2 min,15個循環(huán);72℃7min,產(chǎn)物膠回收后用于酶切。
1.6 Cry2A毒素抗獨特型單鏈抗體庫的構建
分別對lμg膠回收純化的SOE-PCR產(chǎn)物及l(fā)μg帶有BSA單鏈抗體基因的pIT2質粒,采用NotI和Noc I雙酶切。37℃酶切過夜后,80℃滅活10min。酶切產(chǎn)物及質粒用T4連接酶16℃連接過夜,65℃滅活10 min,PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化,去除連接酶及緩沖液中的鹽離子成分,再用無菌水溶解備用。將50μl TG1電轉感受態(tài)和2μl純化后的連接產(chǎn)物加入預冷的lmm電轉杯(共設置10組反應),調(diào)節(jié)電壓為1.25 kV,用Biorad電轉儀進行電轉。電轉產(chǎn)物快速加入lml SOC培養(yǎng)基,37℃,100r/min緩慢振蕩培養(yǎng)1h。取適當稀釋后的培養(yǎng)液涂布1塊含有1%葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的TYE平板(TYE-AG),其余培養(yǎng)液涂布10塊TYE-AG平板,37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日對稀釋液涂布板計數(shù),計算抗體庫庫容。抗體庫的擴增、輔助噬菌體救援方法參考De Wildt等的報道。
1.7 多克隆噬菌體ELISA
采用CBS緩沖液稀釋的10μg/ml Cry2A純化兔多克隆抗體及同樣質量濃度的脫脂奶粉以每孔100μl加入酶標板,4℃包被過夜。次日PBST洗板3次后,每孔200μ1加入2%MPBS,室溫孵育2h。PBST洗板3次后,每孔100μl將從Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫中救援的噬菌體分別加入Cry2A純化兔多克隆抗體及脫脂奶粉包被孔,同樣數(shù)量的未經(jīng)篩選的人源Tomlinson I庫救援噬菌體作為陰性對照,室溫孵育l h。PBST洗板3次,每孔100μl加入5000倍PBS稀釋的HRP標記的抗M13單抗,室溫孵育th。其余顯色步驟同方法1.4中的ELISA操作。讀取Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫和TomlisonI庫分別在Cry2A純化兔多克隆抗體和脫脂奶粉包被孔產(chǎn)生的吸光值,計算信號/背景比值(S/B)。
2 結果與分析
2.1 Protein A純化的抗Cry2A毒素兔多克隆抗體
免疫原的純度是獲得高質量免疫應答效果的重要影響因素之一。除了免疫球蛋白(γ球蛋白)之外,抗血清中還存在大量的白蛋白、α球蛋白、β球蛋白等組分。前期制備的Cry2A兔多克隆抗血清,成分較為混雜,因此采用對兔多克隆抗體Fc片段有強烈結合能力的Protein A柱對抗血清進行了親和純化。經(jīng)過Protein A純化的抗Cry2A毒素兔多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定結果(圖1)顯示,分別在相對分子質量5.5×l04和2.6xl04左右有2個條帶,這是由于抗體經(jīng)過SDS的變性處理后,抗體重鏈和輕鏈之間的二硫鍵打開形成的2條鏈。凝膠上未見其他雜帶,純化效果較好,可以用于下一步的小鼠免疫試驗。
2.2 包被原工作濃度的優(yōu)化及免疫鼠血清效價和抗獨特型組分的測定
由于本試驗所用的二抗HRP標記的羊抗鼠IgG對包被原Cry2A兔多抗血清存在較高的交叉識別,因此在測定免疫鼠血清效價前,需對Cry2A兔多抗血清的包被濃度進行優(yōu)化。優(yōu)化試驗結果(圖2)表明,包被原在100倍到2500倍稀釋范圍內(nèi),鼠陰性血清的吸光值從1.70左右的高背景值,快速下降為0.37,從1.25×104倍到1.50x106稀釋范圍內(nèi),吸光值趨于平衡維持在本底水平(0.30以下)。而1.25×104倍稀釋的免疫鼠血清可以產(chǎn)生3.00以上的吸光值。在保證陰性鼠血清低背景和免疫鼠血清高信號值以及稀釋操作簡便性的綜合考慮下,最終選擇1x104倍稀釋的Cry2A兔多抗血清作為優(yōu)化的包被原濃度,測定免疫鼠血清效價。
在優(yōu)化的包被原工作濃度下,以信號值大于背景值2.1倍計,3只免疫小鼠抗血清效價在1∶1.6x105到1∶6.4xl05倍之間(圖2)。圖3顯示1號免疫鼠血清在250倍到16000倍稀釋范圍內(nèi),可對Cry2A兔多抗和Cry2A毒素的結合產(chǎn)生最高17.6%的抑制。而該濃度范圍的陰性鼠血清對其結合沒有抑制作用。說明l號免疫鼠血清中有部分組分能夠替代Cry2A與兔多克隆抗體結合,為Ab2β型或Ab2γ型抗獨特型抗體。因此,選用效價最高的l號小鼠取脾臟,提取總RNA用于Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫的構建。
2.3 Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫的構建
采用3片段法對單鏈抗體基因進行拼接(圖4)。首先引物VHIBACK-Nco I和VK2BACK分別與VH和VK基因的N端恒定區(qū)互補,引物VHIFOR-2和VK4FOR-Not1分別與VH和VK基因的J片段互補,擴增小鼠的VH、VK基因,同時在VH的5端和VK的3端引入Nco I和NotI 2個酶切位點。另外合成與VH基因、VK基因具有重疊序列的linker片段,最后采用SOE-PCR法完成3個異源片段的連接,并克隆至pIT2載體。
VH、VK和linker基因的PCR擴增結果(圖SA)顯示,VH基因、VK基因分子大小在250 bp至500 bp之間,linker基因位于100bp偏下位置,符合預期分子大小。圖SB顯示pIT2載體通過Nco I和NotI雙酶切,釋放出735bp左右的能識別BSA的人源單鏈抗體基因片段。SOE-PCR反應條件優(yōu)化結果(圖SC)表明,在pfu PCR master mix體系下,scFv基因的擴增條帶均較為模糊:在Taq PCR master mix體系下,采用1000倍稀釋的第1步SOE-PCR產(chǎn)物作為模板,獲得的800bp左右的目的片段最為明亮。最后選用Taq PCR master mix和1000倍稀釋的第1步拼接產(chǎn)物作為模板,對scFv基因進行大量擴增,獲得了較為清晰的800bp左右目的條帶(圖SD)。
scFv基因轉入pIT2載體后,電轉入感受態(tài)TG1,構建的抗體庫庫容為1.2x107。隨機挑取了10個克隆測序,除了1個克隆存在終止密碼子和1個克隆為模板序列外(人源BSA單鏈抗體基因),其余8條均可以翻譯出不同的鼠scFv單鏈抗體基因。圖6為1個從庫中隨機挑取的scFv克隆的DNA堿基序列及其編碼的氨基酸序列,標注了酶切位點、引物、CDR區(qū)及l(fā)inker位置。在Nco I和NotI 2個酶切位點間單鏈抗體基因共有702 bp,其中VH基因336 bp,VK基因321 bp,linker基因45 bp。
2.4 Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫的多克隆噬菌體ELISA分析
Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫經(jīng)輔助噬菌體救援后,用多克隆噬菌體ELISA測定抗體庫對Cry2A兔多克隆抗體的整體結合能力。結果(圖7)顯示,1x107CFU的噬菌體抗體對免疫原結合信號與背景的比值(S/B)為6.04,而未經(jīng)篩選的半合成人源Tomlinson I庫的S/B值為1.33。說明未經(jīng)篩選的Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫對免疫原具有較高的結合能力,下一步將用于Cry2A抗獨特型單鏈抗體的篩選。
3 討論
通常抗獨特型抗體制備有2種方案。第1種方案是將整體抗體消化為5.Ox104左右的Fab片段后與載體蛋白連接用于動物免疫。這樣可以避免整體抗體中的Fc段產(chǎn)生抗體,讓抗獨特型抗體的豐度提高。但是由于該方法需要對整體抗體進行酶切和純化,F(xiàn)ab片段得率較低,對抗體的消耗量較大。消化后的抗體片段免疫原性也會減弱。酶解、純化、載體蛋白偶聯(lián)等步驟,也可能對抗體獨特位的空間構象造成影響。第2種方案是直接將整體抗體作為免疫原用于抗獨特型抗體制備。該方法的優(yōu)點是較為簡單,抗原需求量小,有利于獨特位原始空間結構的維持,但也存在由于抗獨特位較小,導致抗獨特型抗體產(chǎn)生比例較低等問題??紤]到后續(xù)試驗采用的是建立單鏈抗體庫的形式來篩選抗獨特型抗體,在篩選過程中可以采用陰性血清負篩選和抗原競爭性洗脫等方法來去除與Fc片段結合的噬菌體抗體的干擾,我們最終選用了整體抗體免疫的方案。從實際效果看,整體兔多克隆抗體免疫小鼠,最高效價在1∶6.4xl05左右,小鼠的免疫應答效果良好。而且通過免疫鼠血清對Cry2A毒素與其兔多克隆抗體的抑制試驗分析發(fā)現(xiàn),免疫鼠血清對Cry2A與兔多克隆抗體的結合最高可產(chǎn)生約17.6%的抑制,這證明了鼠血清中存在能模擬Cry2A特征結構的Ab2β和Ab2γ型抗獨特型抗體的存在,且比例超過預期值。因此該小鼠的抗體基因可以用于下一步Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫的構建。
單鏈抗體庫的構建主要包括抗體重輕鏈可變區(qū)基因的擴增,載體構建和轉化宿主菌等步驟。其中全套抗體重輕鏈可變區(qū)基因的擴增及拼接是抗體庫構建的難點和主要限速步驟。本研究以小鼠作為免疫動物,構建鼠源免疫抗體庫。小鼠輕鏈有K鏈和λ鏈2種類型,其中K鏈在成年個體中出現(xiàn)的頻率占95%。因此大部分鼠源抗體庫的構建只擴增VK基因。目前國際上已發(fā)表了多套用于小鼠抗體重輕鏈可變區(qū)擴增引物,本研究引物參考了Clarkson等和Olandi等的報道。用Kabat數(shù)據(jù)庫比對成熟抗體VH和VK基因序列,發(fā)現(xiàn)成熟抗體的VH和VK基因的N端相對保守區(qū),另外V和VK基因3端的J片段也較為保守區(qū),本研究用于擴增全套抗體基因的引物正是依據(jù)這些區(qū)域設計。另外,本試驗設計的scFv拼接為2步法,第1步SOE-PCR中,在沒有引物加入的情況下將VH、VK和linker基因等摩爾混合進行循環(huán)擴增。在這一反應中VH基因通過lirtker與VK基因隨機連接起來形成少量的scFv基因。接著將隨機連接的scFv基因稀釋后與引物VH的5 端引物和VK的3端引物混合,在Taq酶的作用下進行第2步SOE-PCR擴增。但是由于第1步SOE-PCR中隨機產(chǎn)生的scFv基因難以定量,而PCR反應的模板濃度也是決定第2步SOE-PCR拼接效果的關鍵因素,因此對第1步SOE-PCR的產(chǎn)物稀釋倍數(shù)進行了優(yōu)化。試驗中還同時考察了pfuPCR master mix和Taq PCR master mix體系對SOE-PCR拼接效果的影響。結果表明1000倍稀釋的第1步拼接產(chǎn)物在Taq PCR master mix體系作用下產(chǎn)生的目的片段最為明亮。因此本試驗最終選擇了1 000倍稀釋的第1步SOE-PCR產(chǎn)物用作第2步拼接的模板。
庫容和多樣性是評價抗體庫質量的關鍵。從抗體庫中隨機挑取的10個克隆測序結果看,其中l(wèi)條為模板序列,這可能是噬菌體載體pIT2酶切不完全導致的,由于該模板序列為識別BSA的單鏈抗體基因,在后期的庫篩選中應注意避免使用BSA作為封閉蛋白而導致模板克隆的富集;另有一條序列在scFv基因中存在終止密碼子。其余8條序列均可翻譯為不同的鼠scFv序列,證明抗體庫具有較好的多樣性。另外,由于本試驗構建的是鼠免疫抗體庫,其抗體可變區(qū)基因高度傾向于能識別的免疫原抗體,因此免疫抗體庫的庫容無需達到天然抗體庫的大庫容水平(lxl08左右)即可篩選到高親和力的目標抗體。有研究者報道lxl06左右的免疫抗體庫即可成功篩選到目標抗體。因此本試驗構建的庫容為1.2x l07Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫可以應用于后期的篩選??贵w庫的多克隆噬菌體ELISA分析結果表明,未經(jīng)篩選的Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫對免疫原的結合信號大大高于未經(jīng)篩選的天然抗體庫,直接證明了Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫的有效性。
本研究采用整體抗體免疫和噬菌體展示技術的路線,成功構建了庫容為1.2×l07的鼠免疫Cry2A抗獨特型單鏈抗體庫,為Cry2A毒素的抗獨特型單鏈抗體的篩選及無毒免疫檢測試劑盒的研制奠定了基礎。