劉媛 劉敏 張霄 徐重新 林曼曼 胡曉丹 仲建鋒 謝雅晶 羅楚平 張存政 劉賢金

摘要：為了降低蘇云金桿菌Cry2A毒素的免疫檢測(cè)成本，開(kāi)發(fā)廉價(jià)、無(wú)毒試劑盒，采用整體抗體免疫和噬菌體展示技術(shù)的路線，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)。以Protein A純化的Cry2A兔多克隆抗體為免疫原，對(duì)雌性Balb/e系小鼠進(jìn)行了免疫。在優(yōu)化的包被原濃度下，用ELISA法測(cè)定小鼠血清效價(jià)及抗獨(dú)特型抗體組分。選取效價(jià)最高的小鼠，取脾臟提取總RNA，RT-PCR法合成cDNA第一鏈。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用PCR法擴(kuò)增小鼠VH、VK基因，再用SOE-PCR法進(jìn)行單鏈抗體基因的拼接。SOE-PCR產(chǎn)物和pIT2載體經(jīng)雙酶切后連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.Coli、TG1完成建庫(kù)，并用多克隆噬菌體ELISA對(duì)抗體庫(kù)與免疫原的結(jié)合能力進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，免疫鼠血清的效價(jià)在1：1.6xl05到1：6.4x l05倍之間。免疫鼠血清可對(duì)Cry2A與其兔多克隆抗體的結(jié)合最高可產(chǎn)生17. 6%的抑制，證明Ab2B和Ab2y型抗獨(dú)特型抗體的存在。最終構(gòu)建了庫(kù)容為1.2xl07的Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)，該抗體庫(kù)與免疫原的結(jié)合信號(hào)/背景比值為6. 04。

關(guān)鍵詞：Cry2A毒素;抗獨(dú)特型抗體;單鏈抗體;噬菌體展示

中圖分類(lèi)號(hào)：X836

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018） 05-1174-09

蘇云金桿菌Cry毒素是全球應(yīng)用最為成功的殺蟲(chóng)蛋白資源，對(duì)多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲(chóng)存在毒性，也對(duì)線形動(dòng)物門(mén)和原生動(dòng)物門(mén)的某些種類(lèi)存在毒性。隨著轉(zhuǎn)Cry毒素基因作物的廣泛種植和在農(nóng)藥制劑中的大量使用Cry毒素，Cry毒素可能存在的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)非靶標(biāo)生物的安全隱患也廣受關(guān)注。為加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管，保障消費(fèi)者的知情權(quán)，國(guó)內(nèi)外各實(shí)驗(yàn)室也陸續(xù)開(kāi)展了Cry毒素檢測(cè)方法的研。其中免疫學(xué)檢測(cè)以其檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)通量大等優(yōu)勢(shì)成為一種主流的檢測(cè)方法。Cry毒素標(biāo)準(zhǔn)品作為免疫學(xué)檢測(cè)的必備試劑，目前主要由美國(guó)Envirologix公司提供，價(jià)格較高，這導(dǎo)致Cry毒素免疫學(xué)檢測(cè)成本的增加。因此，有必要尋找Cry毒素的廉價(jià)、無(wú)毒、安全替代蛋白質(zhì)，創(chuàng)制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物制劑。

抗獨(dú)特型抗體作為一種有效的生物模擬材料，可以模擬多種毒素的特征表位，作為毒素標(biāo)準(zhǔn)品的替代物應(yīng)用于免疫檢測(cè)試劑盒以降低檢測(cè)成本，而且不具毒性。目前已在黃曲霉毒素、微囊藻毒素、嘔吐毒素、富馬毒素、T2毒素等生物毒素的抗獨(dú)特型抗體制備和應(yīng)用中取得成功。但是抗獨(dú)特型抗體技術(shù)的發(fā)展也存在一些制約因素，其中之一是抗獨(dú)特型抗體的制備難度大。以抗獨(dú)特型抗體制備的主流方法單克隆抗體技術(shù)為例，首先是抗獨(dú)特型抗體的陽(yáng)性克隆率低，一般制備成功率是常規(guī)抗體的幾百分之一。其次，抗體分離純化困難。由于抗獨(dú)特型抗體形成過(guò)程中，同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)不同決定簇的α、β、y、δ4種類(lèi)型抗獨(dú)特型抗體，要篩選獲得建立檢測(cè)技術(shù)所需的β或γ型，難度較大。20世紀(jì)90年代興起的抗體庫(kù)技術(shù)，為抗獨(dú)特型抗體的制備提供了新契機(jī)。但是由于從天然抗體庫(kù)中篩選獲得抗獨(dú)特型抗體的幾率較低且親和力不高，因此先通過(guò)動(dòng)物免疫增加抗獨(dú)特型抗體豐度，再構(gòu)建免疫抗體庫(kù)用于篩選，可以大大增加篩選陽(yáng)性率和抗體的親和力。

雖然Cry毒素存在較大的檢測(cè)需求，但是國(guó)內(nèi)外尚無(wú)Cry毒素抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建的報(bào)道。本研究擬聯(lián)合采用整體抗體免疫和噬菌體展示的技術(shù)路線，構(gòu)建Cry2A毒素抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)，為其獨(dú)特型單鏈抗體的篩選和無(wú)毒檢測(cè)試劑盒的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Cry2A多抗血清由本實(shí)驗(yàn)室免疫新西蘭大白兔自制獲得。HiTrap Protein A HP柱、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗M13單抗購(gòu)自美國(guó)GE Health-care公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。6～8周齡雌性BALB/c系小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究中心。Cry2A毒素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Envirologix公司。TR-Izol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。SuperScriptTMⅢ試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和NotI、輔助噬菌體M13K07購(gòu)自美國(guó)NEB公司。2xtaq PCR master mix和2xpfuPCR master mix分別購(gòu)自德國(guó)DBI公司和東盛生物有限公司。半合成人源Tomlinson I庫(kù)、含有牛血清白蛋白（BSA）單鏈抗體基因的pIT2載體、E.Coli.TG1購(gòu)自英國(guó)Source Bioscience有限公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、96孔酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Coming公司。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。脫脂奶粉購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。試驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑及有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 Cry2A兔多克隆抗體的純化與鑒定

參照HiTrap Protein A HP說(shuō)明書(shū)，將實(shí)驗(yàn)室自制的Cry2A兔多抗血清進(jìn)行親和純化。純化抗體用SDS-PAGE檢測(cè)純度，銀染顯色。并以BSA為參照蛋白質(zhì)，用蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定純化抗體濃度，分裝后于-80℃保存。

1.3 動(dòng)物免疫

以Protein A柱純化的Cry2A兔多克隆抗體作為免疫原，免疫3只6～8周齡雌性Balb/c系小鼠，免疫前l(fā)周采集陰性血清。具體免疫程序如下：首免采用每只100μg/ml用50 mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解的免疫原與等體積弗氏完全佐劑混和，乳化成油包水結(jié)構(gòu)后進(jìn)行腹腔注射。14 d后用同樣劑量的免疫原與等體積不完全弗氏佐劑混合乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。此后每隔14 d加強(qiáng)免疫1次。共計(jì)免疫4次。從第2次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后7d，斷尾取血，制備鼠抗血清，用于效價(jià)監(jiān)測(cè)。

1.4 包被原工作濃度優(yōu)化、抗血清效價(jià)及抗獨(dú)特型抗體組分的測(cè)定

用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法優(yōu)化包被原濃度并測(cè)定小鼠抗血清效價(jià)。具體步驟如下：（1）包被：用50mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液（CBS）對(duì)Cry2A兔多抗血清從100倍開(kāi)始進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)靠?00μl加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜。（2）封閉：含0.05% Tween 20的PBS緩沖液（PBST）洗板3次后，每孔200μl加入PBS溶解的2%脫脂奶粉（MPBS），37℃孵育th。（3）加樣：PBST洗板3次后，將最后一次采血得到的l號(hào)鼠抗血清和對(duì)應(yīng)的陰性血清，用PBS稀釋10000倍，每孔100μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育th。（4）加酶標(biāo)二抗：PBST洗板3次后，每孔100μl加入5000倍PBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育lh。（5）顯色：PBST洗板3次后，每孔100μl加入現(xiàn)配的底物溶液（100μl 10mg/ml=甲亞砜溶解的TMB和25μ1 0.65%H202溶于9.875ml 100 mmol/L pH 5.5的檸檬酸緩沖液），37℃顯色15min。（6）終止反應(yīng)：每孔50μl加入2mol/L H2S04，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。小鼠抗血清效價(jià)測(cè)定在優(yōu)化的包被原濃度下進(jìn)行，具體操作同包被原優(yōu)化方法，以吸光值大于陰性孔2.1倍時(shí)的鼠抗血清的最大稀釋倍數(shù)作為效價(jià)。

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定鼠抗血清中抗獨(dú)特型組分。具體操作同包被原優(yōu)化方法，但在以下操作中有改動(dòng)：（1）包被：用2μg/ml Cry2A毒素包被酶標(biāo)板。（2）加樣：每孔加入50μl 250—16000倍PBS稀釋的最后一次采血得到的l號(hào)鼠抗血清與50μ1 10000倍稀釋的Cry2A兔多抗血清，另外以同樣稀釋倍數(shù)的鼠陰性血清與Cry2A兔多抗血清混合，作為陰性對(duì)照。（3）二抗：加入5000倍PBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。其余ELISA步驟同包被原優(yōu)化方法。

1.5 鼠抗體VH和VK基因的擴(kuò)增和拼接

l號(hào)小鼠拉頸處死后取脾臟，參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA。再采用SuperScriptTMⅢ試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。參考Clackson等和Orlandi等的報(bào)道，設(shè)計(jì)VH和VK擴(kuò)增引物（表1）。以cDNA第一鏈為模板，用VHIBACK-Ncol和VHIFOR-2為引物擴(kuò)增VH基因，以Vk2BACK 和 Vk4FOR-Not I（Vk4FORl-Not I、Vk4FOR2-Not I、Vk4FOR3-Not I、Vk4FOR4-Not I等比例混合）為引物擴(kuò)增VK基因，反應(yīng)體系在lxPFUPCR master mix中進(jìn)行。Linker則以pSW2scDl.3基因?yàn)槟０?，LINKBACK和LINKFOR為引物，lxPFUPCR master mix中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件均為94℃5min;94℃ 45s，55℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。產(chǎn)物膠回收后用于下一步scFv基因的拼接。

參考Pasello等的方法進(jìn)行scFv基因拼接。具體為取等摩爾的VH、VK和Linker基因混合后，在lxtaq PCR master mix體系中，進(jìn)行第一步SOE-PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃1 min，65℃1mm，72℃ lmin，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7min。第一步拼接產(chǎn)物用無(wú)菌水稀釋1000倍后，加入含有引物VHIBACK-Ncol和Vk4FORl-Notl的lxtaq PCR master mix體系。PCR條件設(shè)置為94℃ 40s，55℃40 s，72℃2min，5個(gè)循環(huán)：94℃ 40 s，50℃40s，72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán);94℃ 40 s，45℃ 40 s，72℃2 mm，5個(gè)循環(huán)：94℃40 s，40℃ 40 s，72℃ 2 min，15個(gè)循環(huán);72℃7min，產(chǎn)物膠回收后用于酶切。

1.6 Cry2A毒素抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建

分別對(duì)lμg膠回收純化的SOE-PCR產(chǎn)物及l(fā)μg帶有BSA單鏈抗體基因的pIT2質(zhì)粒，采用NotI和Noc I雙酶切。37℃酶切過(guò)夜后，80℃滅活10min。酶切產(chǎn)物及質(zhì)粒用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，65℃滅活10 min，PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，去除連接酶及緩沖液中的鹽離子成分，再用無(wú)菌水溶解備用。將50μl TG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)和2μl純化后的連接產(chǎn)物加入預(yù)冷的lmm電轉(zhuǎn)杯（共設(shè)置10組反應(yīng)），調(diào)節(jié)電壓為1.25 kV，用Biorad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)產(chǎn)物快速加入lml SOC培養(yǎng)基，37℃，100r/min緩慢振蕩培養(yǎng)1h。取適當(dāng)稀釋后的培養(yǎng)液涂布1塊含有1%葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的TYE平板（TYE-AG），其余培養(yǎng)液涂布10塊TYE-AG平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日對(duì)稀釋液涂布板計(jì)數(shù)，計(jì)算抗體庫(kù)庫(kù)容?？贵w庫(kù)的擴(kuò)增、輔助噬菌體救援方法參考De Wildt等的報(bào)道。

1.7 多克隆噬菌體ELISA

采用CBS緩沖液稀釋的10μg/ml Cry2A純化兔多克隆抗體及同樣質(zhì)量濃度的脫脂奶粉以每孔100μl加入酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜。次日PBST洗板3次后，每孔200μ1加入2%MPBS，室溫孵育2h。PBST洗板3次后，每孔100μl將從Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)中救援的噬菌體分別加入Cry2A純化兔多克隆抗體及脫脂奶粉包被孔，同樣數(shù)量的未經(jīng)篩選的人源Tomlinson I庫(kù)救援噬菌體作為陰性對(duì)照，室溫孵育l h。PBST洗板3次，每孔100μl加入5000倍PBS稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13單抗，室溫孵育th。其余顯色步驟同方法1.4中的ELISA操作。讀取Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)和TomlisonI庫(kù)分別在Cry2A純化兔多克隆抗體和脫脂奶粉包被孔產(chǎn)生的吸光值，計(jì)算信號(hào)/背景比值（S/B）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Protein A純化的抗Cry2A毒素兔多克隆抗體

免疫原的純度是獲得高質(zhì)量免疫應(yīng)答效果的重要影響因素之一。除了免疫球蛋白（γ球蛋白）之外，抗血清中還存在大量的白蛋白、α球蛋白、β球蛋白等組分。前期制備的Cry2A兔多克隆抗血清，成分較為混雜，因此采用對(duì)兔多克隆抗體Fc片段有強(qiáng)烈結(jié)合能力的Protein A柱對(duì)抗血清進(jìn)行了親和純化。經(jīng)過(guò)Protein A純化的抗Cry2A毒素兔多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定結(jié)果（圖1）顯示，分別在相對(duì)分子質(zhì)量5.5×l04和2.6xl04左右有2個(gè)條帶，這是由于抗體經(jīng)過(guò)SDS的變性處理后，抗體重鏈和輕鏈之間的二硫鍵打開(kāi)形成的2條鏈。凝膠上未見(jiàn)其他雜帶，純化效果較好，可以用于下一步的小鼠免疫試驗(yàn)。

2.2 包被原工作濃度的優(yōu)化及免疫鼠血清效價(jià)和抗獨(dú)特型組分的測(cè)定

由于本試驗(yàn)所用的二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG對(duì)包被原Cry2A兔多抗血清存在較高的交叉識(shí)別，因此在測(cè)定免疫鼠血清效價(jià)前，需對(duì)Cry2A兔多抗血清的包被濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，包被原在100倍到2500倍稀釋范圍內(nèi)，鼠陰性血清的吸光值從1.70左右的高背景值，快速下降為0.37，從1.25×104倍到1.50x106稀釋范圍內(nèi)，吸光值趨于平衡維持在本底水平（0.30以下）。而1.25×104倍稀釋的免疫鼠血清可以產(chǎn)生3.00以上的吸光值。在保證陰性鼠血清低背景和免疫鼠血清高信號(hào)值以及稀釋操作簡(jiǎn)便性的綜合考慮下，最終選擇1x104倍稀釋的Cry2A兔多抗血清作為優(yōu)化的包被原濃度，測(cè)定免疫鼠血清效價(jià)。

在優(yōu)化的包被原工作濃度下，以信號(hào)值大于背景值2.1倍計(jì)，3只免疫小鼠抗血清效價(jià)在1∶1.6x105到1∶6.4xl05倍之間（圖2）。圖3顯示1號(hào)免疫鼠血清在250倍到16000倍稀釋范圍內(nèi)，可對(duì)Cry2A兔多抗和Cry2A毒素的結(jié)合產(chǎn)生最高17.6%的抑制。而該濃度范圍的陰性鼠血清對(duì)其結(jié)合沒(méi)有抑制作用。說(shuō)明l號(hào)免疫鼠血清中有部分組分能夠替代Cry2A與兔多克隆抗體結(jié)合，為Ab2β型或Ab2γ型抗獨(dú)特型抗體。因此，選用效價(jià)最高的l號(hào)小鼠取脾臟，提取總RNA用于Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建。

2.3 Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建

采用3片段法對(duì)單鏈抗體基因進(jìn)行拼接（圖4）。首先引物VHIBACK-Nco I和VK2BACK分別與VH和VK基因的N端恒定區(qū)互補(bǔ)，引物VHIFOR-2和VK4FOR-Not1分別與VH和VK基因的J片段互補(bǔ)，擴(kuò)增小鼠的VH、VK基因，同時(shí)在VH的5端和VK的3端引入Nco I和NotI 2個(gè)酶切位點(diǎn)。另外合成與VH基因、VK基因具有重疊序列的linker片段，最后采用SOE-PCR法完成3個(gè)異源片段的連接，并克隆至pIT2載體。

VH、VK和linker基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖SA）顯示，VH基因、VK基因分子大小在250 bp至500 bp之間，linker基因位于100bp偏下位置，符合預(yù)期分子大小。圖SB顯示pIT2載體通過(guò)Nco I和NotI雙酶切，釋放出735bp左右的能識(shí)別BSA的人源單鏈抗體基因片段。SOE-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果（圖SC）表明，在pfu PCR master mix體系下，scFv基因的擴(kuò)增條帶均較為模糊：在Taq PCR master mix體系下，采用1000倍稀釋的第1步SOE-PCR產(chǎn)物作為模板，獲得的800bp左右的目的片段最為明亮。最后選用Taq PCR master mix和1000倍稀釋的第1步拼接產(chǎn)物作為模板，對(duì)scFv基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，獲得了較為清晰的800bp左右目的條帶（圖SD）。

scFv基因轉(zhuǎn)入pIT2載體后，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)TG1，構(gòu)建的抗體庫(kù)庫(kù)容為1.2x107。隨機(jī)挑取了10個(gè)克隆測(cè)序，除了1個(gè)克隆存在終止密碼子和1個(gè)克隆為模板序列外（人源BSA單鏈抗體基因），其余8條均可以翻譯出不同的鼠scFv單鏈抗體基因。圖6為1個(gè)從庫(kù)中隨機(jī)挑取的scFv克隆的DNA堿基序列及其編碼的氨基酸序列，標(biāo)注了酶切位點(diǎn)、引物、CDR區(qū)及l(fā)inker位置。在Nco I和NotI 2個(gè)酶切位點(diǎn)間單鏈抗體基因共有702 bp，其中VH基因336 bp，VK基因321 bp，linker基因45 bp。

2.4 Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的多克隆噬菌體ELISA分析

Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)經(jīng)輔助噬菌體救援后，用多克隆噬菌體ELISA測(cè)定抗體庫(kù)對(duì)Cry2A兔多克隆抗體的整體結(jié)合能力。結(jié)果（圖7）顯示，1x107CFU的噬菌體抗體對(duì)免疫原結(jié)合信號(hào)與背景的比值（S/B）為6.04，而未經(jīng)篩選的半合成人源Tomlinson I庫(kù)的S/B值為1.33。說(shuō)明未經(jīng)篩選的Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)對(duì)免疫原具有較高的結(jié)合能力，下一步將用于Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體的篩選。

3 討論

通?？躬?dú)特型抗體制備有2種方案。第1種方案是將整體抗體消化為5.Ox104左右的Fab片段后與載體蛋白連接用于動(dòng)物免疫。這樣可以避免整體抗體中的Fc段產(chǎn)生抗體，讓抗獨(dú)特型抗體的豐度提高。但是由于該方法需要對(duì)整體抗體進(jìn)行酶切和純化，F(xiàn)ab片段得率較低，對(duì)抗體的消耗量較大。消化后的抗體片段免疫原性也會(huì)減弱。酶解、純化、載體蛋白偶聯(lián)等步驟，也可能對(duì)抗體獨(dú)特位的空間構(gòu)象造成影響。第2種方案是直接將整體抗體作為免疫原用于抗獨(dú)特型抗體制備。該方法的優(yōu)點(diǎn)是較為簡(jiǎn)單，抗原需求量小，有利于獨(dú)特位原始空間結(jié)構(gòu)的維持，但也存在由于抗獨(dú)特位較小，導(dǎo)致抗獨(dú)特型抗體產(chǎn)生比例較低等問(wèn)題。考慮到后續(xù)試驗(yàn)采用的是建立單鏈抗體庫(kù)的形式來(lái)篩選抗獨(dú)特型抗體，在篩選過(guò)程中可以采用陰性血清負(fù)篩選和抗原競(jìng)爭(zhēng)性洗脫等方法來(lái)去除與Fc片段結(jié)合的噬菌體抗體的干擾，我們最終選用了整體抗體免疫的方案。從實(shí)際效果看，整體兔多克隆抗體免疫小鼠，最高效價(jià)在1∶6.4xl05左右，小鼠的免疫應(yīng)答效果良好。而且通過(guò)免疫鼠血清對(duì)Cry2A毒素與其兔多克隆抗體的抑制試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，免疫鼠血清對(duì)Cry2A與兔多克隆抗體的結(jié)合最高可產(chǎn)生約17.6%的抑制，這證明了鼠血清中存在能模擬Cry2A特征結(jié)構(gòu)的Ab2β和Ab2γ型抗獨(dú)特型抗體的存在，且比例超過(guò)預(yù)期值。因此該小鼠的抗體基因可以用于下一步Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建。

單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建主要包括抗體重輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增，載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化宿主菌等步驟。其中全套抗體重輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增及拼接是抗體庫(kù)構(gòu)建的難點(diǎn)和主要限速步驟。本研究以小鼠作為免疫動(dòng)物，構(gòu)建鼠源免疫抗體庫(kù)。小鼠輕鏈有K鏈和λ鏈2種類(lèi)型，其中K鏈在成年個(gè)體中出現(xiàn)的頻率占95%。因此大部分鼠源抗體庫(kù)的構(gòu)建只擴(kuò)增VK基因。目前國(guó)際上已發(fā)表了多套用于小鼠抗體重輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增引物，本研究引物參考了Clarkson等和Olandi等的報(bào)道。用Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)成熟抗體VH和VK基因序列，發(fā)現(xiàn)成熟抗體的VH和VK基因的N端相對(duì)保守區(qū)，另外V和VK基因3端的J片段也較為保守區(qū)，本研究用于擴(kuò)增全套抗體基因的引物正是依據(jù)這些區(qū)域設(shè)計(jì)。另外，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的scFv拼接為2步法，第1步SOE-PCR中，在沒(méi)有引物加入的情況下將VH、VK和linker基因等摩爾混合進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。在這一反應(yīng)中VH基因通過(guò)lirtker與VK基因隨機(jī)連接起來(lái)形成少量的scFv基因。接著將隨機(jī)連接的scFv基因稀釋后與引物VH的5 端引物和VK的3端引物混合，在Taq酶的作用下進(jìn)行第2步SOE-PCR擴(kuò)增。但是由于第1步SOE-PCR中隨機(jī)產(chǎn)生的scFv基因難以定量，而PCR反應(yīng)的模板濃度也是決定第2步SOE-PCR拼接效果的關(guān)鍵因素，因此對(duì)第1步SOE-PCR的產(chǎn)物稀釋倍數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)中還同時(shí)考察了pfuPCR master mix和Taq PCR master mix體系對(duì)SOE-PCR拼接效果的影響。結(jié)果表明1000倍稀釋的第1步拼接產(chǎn)物在Taq PCR master mix體系作用下產(chǎn)生的目的片段最為明亮。因此本試驗(yàn)最終選擇了1 000倍稀釋的第1步SOE-PCR產(chǎn)物用作第2步拼接的模板。

庫(kù)容和多樣性是評(píng)價(jià)抗體庫(kù)質(zhì)量的關(guān)鍵。從抗體庫(kù)中隨機(jī)挑取的10個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果看，其中l(wèi)條為模板序列，這可能是噬菌體載體pIT2酶切不完全導(dǎo)致的，由于該模板序列為識(shí)別BSA的單鏈抗體基因，在后期的庫(kù)篩選中應(yīng)注意避免使用BSA作為封閉蛋白而導(dǎo)致模板克隆的富集;另有一條序列在scFv基因中存在終止密碼子。其余8條序列均可翻譯為不同的鼠scFv序列，證明抗體庫(kù)具有較好的多樣性。另外，由于本試驗(yàn)構(gòu)建的是鼠免疫抗體庫(kù)，其抗體可變區(qū)基因高度傾向于能識(shí)別的免疫原抗體，因此免疫抗體庫(kù)的庫(kù)容無(wú)需達(dá)到天然抗體庫(kù)的大庫(kù)容水平（lxl08左右）即可篩選到高親和力的目標(biāo)抗體。有研究者報(bào)道lxl06左右的免疫抗體庫(kù)即可成功篩選到目標(biāo)抗體。因此本試驗(yàn)構(gòu)建的庫(kù)容為1.2x l07Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)可以應(yīng)用于后期的篩選?？贵w庫(kù)的多克隆噬菌體ELISA分析結(jié)果表明，未經(jīng)篩選的Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)對(duì)免疫原的結(jié)合信號(hào)大大高于未經(jīng)篩選的天然抗體庫(kù)，直接證明了Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)的有效性。

本研究采用整體抗體免疫和噬菌體展示技術(shù)的路線，成功構(gòu)建了庫(kù)容為1.2×l07的鼠免疫Cry2A抗獨(dú)特型單鏈抗體庫(kù)，為Cry2A毒素的抗獨(dú)特型單鏈抗體的篩選及無(wú)毒免疫檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。