羅彥波等

摘 要 采用改進(jìn)QuEChERS方法，以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/磁性四氧化三鐵復(fù)合材料為吸附劑，對(duì)煙葉提取物進(jìn)行凈化，結(jié)合在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，建立了煙葉中10種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。優(yōu)化了影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)，最終凝膠滲透色譜在線收集時(shí)間選取為3.30～5.30 min、磁性吸附劑用量為80 mg、凈化時(shí)間為1.0 min。目標(biāo)物的檢出限在0.940～100 ng/L之間，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9989，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于15.1%和19.8%，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為68.8%～132.2%。本方法成功應(yīng)用于實(shí)際煙葉樣品的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法相吻合。

關(guān)鍵詞 QuEChERS方法； 在線； 凝膠滲透色譜； 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 煙葉； 農(nóng)藥殘留

1 引 言

為了防治病蟲害，煙草在育種、種植、調(diào)制和保存期間要使用農(nóng)藥。殘留農(nóng)藥會(huì)降低煙葉質(zhì)量，加劇環(huán)境污染， 并威脅人類和其它生物的健康[1]。因此，煙葉中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)對(duì)保證煙葉質(zhì)量和環(huán)境安全具有重要意義。由于煙葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中殘留農(nóng)藥含量低（低至ng/g級(jí)），因此通常需要樣品預(yù)處理過(guò)程才能進(jìn)行后續(xù)測(cè)定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于煙葉中農(nóng)藥殘留測(cè)定。這些方法存在有機(jī)溶劑消耗量大、操作繁冗費(fèi)時(shí)、回收率低等不足。Anastassiades等[6]開發(fā)了“快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的樣品前處理技術(shù)。QuEChERS方法具有回收率高、穩(wěn)定性強(qiáng)和被分析目標(biāo)物范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[3]。常規(guī)QuEChERS方法在凈化步驟中通過(guò)離心或過(guò)濾將吸附劑與樣品液分離，耗時(shí)費(fèi)力。為了克服這一缺陷，本研究組以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/四氯化三鐵（GCB/PSA/Fe3O4）復(fù)合材料為吸附劑，改進(jìn)了QuEChERS方法[7]，吸附劑可以在磁場(chǎng)作用下與提取液快速分離，具有操作簡(jiǎn)單、快速高效的優(yōu)點(diǎn)。

在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜（GPC-GC-MS）是將凝膠滲透色譜和氣相色譜-質(zhì)譜在線聯(lián)用的分析檢測(cè)技術(shù)，不但具有抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且可以連續(xù)自動(dòng)分析，能提高分析速度和結(jié)果的準(zhǔn)確性，已被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)[8～10]。本研究采用改進(jìn)QuEChERS方法對(duì)煙葉樣品前處理，以在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GPC-GC-MS/MS）檢測(cè)，選取煙草種植生產(chǎn)中對(duì)煙葉質(zhì)量和煙草制品產(chǎn)品安全有影響的常用10種除草劑、抑芽劑和殺蟲劑為代表性化合物，建立了煙葉中農(nóng)藥殘留量的快速、準(zhǔn)確、靈敏分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)（日本島津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A3R脫氣機(jī)和SPD-20A紫外檢測(cè)器；GC-MS/MS包括日本島津2010-plus氣相色譜和TQ 8030三重四級(jí)桿質(zhì)譜，由FCV-12AH電磁閥實(shí)現(xiàn)GPC和GC-MS/MS的在線連接。用Quanta 200 掃描電鏡（Quanta 200，F(xiàn)EI，Holland）對(duì)材料形貌進(jìn)行表征。

環(huán)己烷和丙酮（色譜純，韓國(guó)德山純化工有限公司）。所用水由Milli-Q系統(tǒng)（Milford， MA， USA）制得。10種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)（磷酸三苯酯）均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要時(shí)添加丙酮或甲醇）為溶劑配制目標(biāo)物母液（100 μg/mL）?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶劑熱方法制備Fe3O4[7]：在200 mL反應(yīng)釜內(nèi)將5.0 g FeCl3·6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并攪拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，攪拌30 min，將反應(yīng)釜于200℃下反應(yīng)8 h。待反應(yīng)釜降溫后，用水和乙醇清洗產(chǎn)物， 60℃下干燥，備用。制備磁性吸附劑時(shí)，將0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具蓋玻璃瓶?jī)?nèi)，用5 mL乙腈清洗3次后，將產(chǎn)物在60℃下干燥即可。

2.2 儀器條件

GPC條件：色譜柱為Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱溫為40℃；流動(dòng)相為環(huán)己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；GPC收集時(shí)間為3.30～5.30 min；GC-MS/MS條件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；預(yù)柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分離柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱溫箱程序：初始溫度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間7.0 min；高純He為載氣，壓力程序：由120 kPa開始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢復(fù)至原始?jí)毫?，保?3.8 min；程序升溫進(jìn)樣口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和離子源溫度為300℃和200℃；電離源為EI源；電離電壓70 eV；溶劑延遲時(shí)間15 min；目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)如表1所示，碰撞氣為Ar，壓力200 kPa。

2.3 樣品制備

本研究建立煙葉提取液快速凈化和檢測(cè)的方法，因此直接采用文獻(xiàn)＼[2＼]報(bào)道的方法提取煙葉： 稱取2.00 g 煙葉于離心管中，加入10 mL水浸潤(rùn)樣品；靜置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 無(wú)水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉，振蕩2 min后離心5 min，收集上層提取液；提取液的凈化和檢測(cè)方法為：取0.5 mL提取液到裝有磁性吸附劑的離心管中，振蕩1 min；在磁場(chǎng)下將磁性吸附劑與溶液分離，所得溶液為待測(cè)液，可進(jìn)行在線GPC-GC-MS/MS分析。將不含目標(biāo)物的凈化液濃縮吹干，再加入相同體積、不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混勻溶解即得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 磁性吸附劑的表征

如圖1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附劑中PSA表面粗糙（圖1b），且在PSA顆粒之間也有材料均勻分布，觀察是GCB和Fe3O4顆粒（圖1c）。Fe3O4能使吸附劑在磁場(chǎng)作用下與樣品溶液快速分離，同時(shí)PSA和GCB能分離提取液中的雜質(zhì)。

3.2 GPC收集時(shí)間考察

圖2為在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)的示意圖。其原理為：樣品經(jīng)GPC柱分離，廢液直接排出系統(tǒng)，含有目標(biāo)物的餾分先被儲(chǔ)存在定量環(huán)（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的樣品通過(guò)打開溶劑蒸氣出口實(shí)現(xiàn)溶劑的排出，同時(shí)目標(biāo)分析物在保留在預(yù)柱中。待溶劑排出口關(guān)閉后柱，溫箱開始升溫，目標(biāo)物進(jìn)入分析柱分離。因此選擇收集時(shí)間顯得尤為重要。目標(biāo)物的分子量在溴氰菊酯和滅螨蜢之間，因此目標(biāo)物在GPC上的保留時(shí)間也介于二者之間，二者在GPC上的保留時(shí)間為3.50和5.08 min?？紤]靈敏度和基質(zhì)去除效果，確定收集時(shí)間為3.30～5.30 min。

3.3 改進(jìn)QuEChERS方法的優(yōu)化

為了得到較好的凈化效果，優(yōu)化了磁性吸附劑的用量和凈化時(shí)間（GCB、PSA和Fe3O4之間的質(zhì)量比為4∶5∶10）。如圖3a所示，隨著吸附劑用量增加，提取液的顏色由黃色逐漸變?yōu)榻鼰o(wú)色，當(dāng)吸附劑用量達(dá)到80 mg時(shí)，繼續(xù)增加用量對(duì)凈化效果改善不大。且在考察的范圍內(nèi)，各目標(biāo)物的峰面積沒有變化，這可能是因?yàn)樵跓熑~提取液中含有甲苯，使吸附劑與含苯環(huán)目標(biāo)物之間的相互作用力減弱而引起的。考慮凈化效果和吸附劑用量，將吸附劑的用量定為80 mg。在0.5～6.0 min范圍內(nèi)，凈化時(shí)間對(duì)凈化效果影響不大，且目標(biāo)物的峰面積沒有變化，這是因?yàn)槲絼┰趦艋瘯r(shí)是分散的，可以使吸附快速達(dá)到平衡，因此凈化時(shí)間對(duì)凈化效果沒有太大影響。為了穩(wěn)定凈化效果，凈化時(shí)間選取1.0 min。

比較了本方法與常規(guī)QuEChERS方法的凈化效果，如圖3b所示，未經(jīng)凈化的煙葉提取液顏色為黃色，經(jīng)過(guò)常規(guī)QuEChERS方法凈化后，提取液顏色變淺；經(jīng)過(guò)本方法凈化后，提取液幾乎無(wú)色（Ⅲ）。因此，本方法對(duì)色素等雜質(zhì)的去除效果較好。

3.4 方法確認(rèn)

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限、定量限、線性范圍和重現(xiàn)性。檢出限和定量限為目標(biāo)物信噪比為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。以目標(biāo)物濃度及其與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫、縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。如表2所示，10種目標(biāo)物的檢出限在0.94～100 ng/L之間，定量限在3.1～34 ng/L之間，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9989。本方法提取煙葉的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法[11]相同，其中9種目標(biāo)物（甲氰菊酯除外）的檢出限為40～600 ng/L。本方法能顯著提高靈敏度，是由吸附劑降低基質(zhì)干擾和在線GPC-GC-MS/MS提高進(jìn)樣量引起的。

為了考察本方法的重現(xiàn)性，配制3種濃度（各目標(biāo)物線性范圍最低值的2、10和100倍）的樣品，以一天內(nèi)配制的4個(gè)樣品和連續(xù)3天配制的樣品進(jìn)行分析，計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示，目標(biāo)物的日內(nèi)及日間精密度分別小于15.1%和19.8%，其中目標(biāo)物在中濃度和高濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值不高于8.5%，低濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值相對(duì)較高，這可能是由于測(cè)定誤差引起的。美國(guó)分析化學(xué)家學(xué)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度數(shù)值隨著分析物的濃度或含量降低而升高。本研究中目標(biāo)物在低濃度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度數(shù)值低于21%（目標(biāo)物濃度為10 μg/L時(shí)所能接受的精密度數(shù)值），說(shuō)明本方法的重現(xiàn)性可以接受。

3.5 實(shí)際樣品分析

為了證明本方法在實(shí)際樣品中應(yīng)用的效果，采用本方法和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法[11]處理3種煙葉樣品并進(jìn)行測(cè)定。在樣品A中測(cè)到了七氟菊酯、二甲戊靈和聯(lián)苯菊酯，采用本方法和標(biāo)準(zhǔn)方法均無(wú)法對(duì)其進(jìn)行定量分析；在樣品B中測(cè)到了七氟菊酯，兩種方法的測(cè)定結(jié)果為1.06和1.03 μg/L，對(duì)氟節(jié)胺和聯(lián)苯菊酯均無(wú)法進(jìn)行定量分析；在樣品C中測(cè)到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，兩種方法的測(cè)定結(jié)果為92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，對(duì)七氟菊酯也均無(wú)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法[11]的檢測(cè)結(jié)果相吻合。樣品C中測(cè)到的目標(biāo)物數(shù)目最多，給出了其中被測(cè)到目標(biāo)物的典型色譜圖。如圖4所示，目標(biāo)物均不存在干擾。同時(shí)，對(duì)凈化前的煙葉提取液直接進(jìn)行在線GPC-GC-MS/MS分析，檢測(cè)結(jié)果與以上兩種方法不存在顯著性差異：在樣品B中測(cè)到了七氟菊酯，其濃度為1.01 μg/L；在樣品C中測(cè)到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，其濃度為92.8， 110.2和3.81 μg/L。

將上述3種樣品加標(biāo)后用本方法測(cè)定，將所測(cè)量與實(shí)際加標(biāo)量相比得到相對(duì)回收率。如表4所示，目標(biāo)物的相對(duì)回收率在68.8%～132.2%之間，不同實(shí)際樣品中目標(biāo)物在不同濃度下的回收率相差較大，可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)地?zé)熑~樣品的基質(zhì)差異引起的。使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)煙葉中的農(nóng)藥殘留時(shí)，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)同時(shí)都存在[13]，其中含有氨基的極性農(nóng)藥化合物在氣相色譜分析時(shí)主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（如二甲戊靈和聯(lián)苯菊酯，回收率最高為132.2%），但含有同一功能基團(tuán)的化合物由于理化特性的差異所呈現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)有較大差別（如七氟菊酯，回收率最低為68.8%），而且同一化合物在不同濃度水平和樣品基質(zhì)下產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)程度也不盡相同（如甲氰菊酯）[14]。

4 結(jié) 論

采用磁性吸附劑凈化煙葉提取液，再用在線GPC-GC-MS/MS檢測(cè)，優(yōu)化了在線GPC-GC-MS/MS條件和影響凈化效果的因素，在最佳的條件下建立了煙葉樣品中10種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定新方法，并用于實(shí)際煙葉樣品的測(cè)定。由于磁性吸附劑可以在磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)快速回收，且在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)可以提高進(jìn)樣量。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法[11]相比，本方法具有樣品前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)單、凈化能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為日常煙葉樣品中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定提供了一種可選擇的方法。

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