曹興 郭尚敬 高祥斌 呂福堂 隋娟娟 穆紅梅 吳澤 義鳴放 張秀省

摘要：為了深入研究百合響應(yīng)高溫脅迫的分子機制，本研究以麝香百合雜種系品種白天堂為試驗材料，從中分離得到1個MBFle基因，其開放閱讀框為438bp，編碼145個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為15900，理論等電點為10.22。多序列同源比對和進化樹分析表明百合MBFle具有典型的MBF1和HTH結(jié)構(gòu)域，歸屬c亞型MBF1，因此將克隆到的基因命名為LIMBFle。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，LIMBFle可能介導(dǎo)了熱激信號由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，LIMBFle在葉中的表達(dá)量最高，根中次之，鱗莖中最低;LIMBFle的表達(dá)受熱激誘導(dǎo)。表明，LIMBFle基因可能與百合的熱激反應(yīng)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：百合;MBF1;基因克隆;亞細(xì)胞定位;表達(dá)分析

中圖分類號：Q785

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1120-08

百合（Lilium spp.）為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食用和藥用價值。百合性喜冷涼、濕潤氣候，耐熱性較差，然而中國大部分地區(qū)夏季炎熱，高溫造成百合生長停滯、植株矮小、少花盲花、莖稈軟、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成種球退化，制約著中國百合商品化周年生產(chǎn)。所以，提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵。在百合野生種中，麝香百合（Lilium longiflorumThunb）和臺灣百合（Lilium formosanum Wallace）的耐熱性較強，它們的雜交品種也具有較強的耐熱性。因此，解析耐熱百合品種的高溫逆境響應(yīng)機制，鑒定調(diào)控耐熱性的關(guān)鍵基因，對于采用基因工程技術(shù)來提高百合的耐熱性具有重要的理論和實踐意義。

目前的研究結(jié)果表明，植物響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控途徑主要有：熱激轉(zhuǎn)錄因子一熱激蛋白（HSF-HSP）途徑、鈣離子一鈣調(diào)蛋白（Ca2+_CaM）途徑、活性氧（ROS）途徑、激素調(diào)控途徑、細(xì)胞未折疊蛋白響應(yīng)（UPR）途徑和核小體介導(dǎo)途徑。細(xì)胞內(nèi)的這些調(diào)控途徑相互交叉組成了植物的熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。近年來，植物多蛋白橋梁因子（Multiprotein bridgingfactor lc.MBFlc）被鑒定為調(diào)控植物耐熱性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。MBFlc又稱轉(zhuǎn)錄輔激活因子（Tran-scriptional Co-activator），可以連接通用轉(zhuǎn)錄因子TBP（TATA-box Binding Protein）和基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，從而增強特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，最終促進靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，MBFlc涉及通過激素、HSF-HSP、ROS和Ca2+信號途徑調(diào)控植物的耐熱性，是植物熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點。

本研究以耐熱性較好的麝香百合雜種系品種白天堂（L.lon，giflorum cv.White Heaven）為試驗材料，從中克隆了MBFlc基因，分析百合MBFlc蛋白特性及MBFlc基因在熱脅迫下的表達(dá)模式，以期為進一步研究MBFlc基因在百合耐熱性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為麝香百合雜種系品種白天堂組培苗，培養(yǎng)條件為22℃，光照時間為16h/d。亞細(xì)胞定位使用的材料為紫皮洋蔥（Allium cepa）。

RNA提取試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)DH5a購自北京天根生化科技有限公司，DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司.5'-Full RACE kit、pMD18-T載體、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司，熒光定量試劑盒SYBRFAST qPCR Universal Kit購自KAPA公司，氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）購自Sigma公司，其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（試驗所用引物見表1）;DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 LIMBFlc全長cDNA克隆 用37℃熱激處理百合組培苗2h，然后取0.1g葉片用液氮研磨提取RNA。RNA的提取根據(jù)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進行。用NanoDrop 2000 Spectro-photometer（Thermo，USA）檢測吸光值（A260/A 230和A260/A280）判斷RNA的質(zhì)量，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成根據(jù)TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）說明書進行，反轉(zhuǎn)錄接頭引物為AP。

基因保守片段的克?。焊鶕?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的其他植物MBFlc mRNA序列，通過DNAman5軟件進行同源比對，設(shè)計保守區(qū)兼并引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用巢式PCR擴增中間保守片段，第一輪引物為DPF1（上游）和DPR1（下游），反應(yīng)程序為：94℃5 min;94℃30s，57℃ 30 s，72℃40s，33個循環(huán);72℃10 min。取1μ1產(chǎn)物作第二輪反應(yīng)的模板，第二輪引物為DPF2（上游）和DPR2（下游），反應(yīng)程序為：94℃5 min;94℃30s.58℃30 s.72℃ 30 s，33個循環(huán);72℃10 min。

基因3端序列的克?。和ㄟ^RACE（Rapid Am-plification of cDNA Ends）的方法獲得目的基因的3端序列。以cDNA為模板，根據(jù)已經(jīng)克隆的目的基因保守片段設(shè)計2條上游特異引物，分別與下游的3接頭引物進行PCR擴增。第一輪引物為SPF1和AP1，反應(yīng)程序為：94℃5 min;94 0C 30 s.63℃30s，72℃1?min，33個循環(huán)：72℃10 min。第二輪引物為SPF2和AP2，反應(yīng)程序為：94℃5 min; 94℃30 s，62℃ 30 s，72℃50 s，33個循環(huán);72℃ 10min。

基因5端序列的克?。喊凑誘aKaRa公司5-FullRACE kit說明書進行，用Random 9 mers引物進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已經(jīng)獲得的目的基因片段設(shè)計2條下游特異引物SPR1和SPR2，與試劑盒自帶的2條5端接頭引物進行巢式PCR擴增。第一輪PCR擴增引物為5'RACE Outer primer和特異引物SPR1，反應(yīng)程序為：94℃5min;94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 50 s，25個循環(huán)：72℃10 min。取第一輪產(chǎn)物1μl進行第二輪反應(yīng)，引物為5 RACE Inner primer，特異引物為SPR2，反應(yīng)程序為：94℃5min;94℃ 30s.62℃30s，72℃ 40s，33個循環(huán)：72℃ 10min。

開放閱讀框（Open reading frame，ORF）序列的校正：將已經(jīng)獲得的目的基因5片段、中間片段和3片段用DNAMAN 5拼接，并在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上預(yù)測其ORF，在起始密碼子上游設(shè)計特異引物SPF3（上游），在終止密碼子下游設(shè)計特異引物SPR3（下游），用保真性較高的TaKaRaPrimeSTAR@HS DNA Polymerase擴增目的基因的ORF序列。反應(yīng)程序為：94℃ 5min;94℃ 30s，55℃30s，72℃40s，33個循環(huán);72℃10min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，Amp抗性培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，將含有目的基因片段的陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.2 LIMBFlc的生物信息學(xué)分析用Primer Prem-ier 5軟件將目的基因的ORF序列翻譯成氨基酸序列;用EXPASY （https：//www.expasy.org/tools/）中的ProtParam、SMART、SignalP、TMHMM、PSORT等工具對氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析：用NCBI的BLAST功能和DNAMAN 5對LIMBFlc進行多重比對分析：用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 LIMBFlc的亞細(xì)胞定位 利用DNAMAN 5分析LIMBFlc的ORF序列的酶切位點，結(jié)合pCAM-BIA1300載體，選用Sal I和Spe I作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點，并設(shè)計上游特異引物SPF4和下游特異引物SPR4進行PCR擴增。雙酶切pCAM-BIA1300空載質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物，純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接，獲得pCAMBIA1300-LlMBF/c-GFP重組表達(dá)載體，雙酶切和測序驗證連接是否成功。用基因槍轟擊法將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-LiMBF/c-GFP重組表達(dá)載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h的洋蔥表皮細(xì)胞中，分別置于22℃和37℃暗培養(yǎng)24 h，空載pCAMBIA1300-GFP作為對照。用激光共聚焦顯微鏡（Nikon Eclipse TE2000-E）觀察和拍照，并用EZ-C1軟件分析和處理照片。

1.2.4

LIMBFlc的表達(dá)分析選擇生長良好、長勢一致的白天堂組培苗作為基因表達(dá)分析的材料。

LIMBFlc在不同組織中的表達(dá)：分別取常溫（22℃）培養(yǎng)的百合組培苗的根、鱗莖和葉片。LIMBFlc在不同熱激時間下的表達(dá)：用37 cC熱激百合的組培苗，分別在處理0.5h、1.0h、2.0h、4.0h和8.0h時取葉片，以常溫（22℃）為對照。LIMBFlc受Ca2+處理的表達(dá)：分別在22℃、37 cC條件下，用20 ml 20mmol/L CaCl，、10 mmol/L EGTA溶液浸沒百合組培苗根系2.0 h后取葉片，用去離子水處理作為對照。

所取組織用液氮速凍并保存于-80 cC的超低溫冰箱中備用提取RNA，RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄方法同方法1.2.1。采用熒光定量PCR（Real-time fluores-cence quantitative PCR，qPCR）的方法檢測基因的表達(dá)，LIMBF lc的擴增引物為qFl和qRl，內(nèi)參基因18S RNA的擴增引物為18S qF和I8S qR。試驗參照SYBR FAST qPCR Universal Kit熒光定量試劑盒說明書進行，儀器為Applied Biosystems Step Onesystem PCR儀。反應(yīng)程序為：95℃3 min;95℃3s，55℃30 s，72℃20s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。采用2-△△方法分析基因的相對表達(dá)量，用Excel 2003和SPSS 18軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LIMBFlc的cDNA全長克隆

通過同源克隆的方法獲得目的基因的中間保守片段序列，通過RACE的方法獲得目的基因的3'端和5端序列，利用DNAMAN 5拼接得到全長為620bp的序列，其中ORF區(qū)序列長為438 bp，編碼145個氨基酸（圖1）。BIAST的結(jié)果顯示，該基因與其他物種的MBFlc基因有較高的同源性，將其命名為LIMBFlc。

2.2 百合LIMBFlc蛋白的生物信息學(xué)分析

ProtParam在線工具預(yù)測百合LIMBFlc蛋白包含145個氨基酸殘基，分子式為C696H1182N2160201S3，分子量為15900。親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.47（<0），屬于親水蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為36.12（<40），屬于穩(wěn)定蛋白，半衰期在大腸桿菌（Escherichiacoli）中大于10 h，在酵母菌（Saccharomyces cerevisi-ae）中大于20 h。氨基酸組成成分分析結(jié)果表明，LIMBFlc肽鏈負(fù)電荷殘基（天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu）為16，正電荷殘基（精氨酸Arg+賴氨酸Lys）為29，理論等電點（ P/）為10.22，屬于堿性蛋白。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測程序SignalP預(yù)測分值為0.1l（<0. 50），表明LIMBFlc不含信號肽。蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測軟件TMHMM未發(fā)現(xiàn)LIMBFlc有明顯的跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位工具PSORT預(yù)測LIMBFlc主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)。將LIMBFlc與擬南芥（Arabidopsis thalian，a）、蕪菁（Brassica rapa）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、葡萄（Vitisvinifera）的MBFlc氨基酸序列進行同源比對，結(jié)果（圖2）表明，LIMBFlc蛋白與其他物種的MBFlc蛋白類似，在靠近N端11—81個氨基酸殘基內(nèi)含有1個典型的MBF1結(jié)構(gòu)域，在靠近C端部分（88～ 143aa）含有1個α螺旋一轉(zhuǎn)角-α螺旋（Helix-Tum-Helix，HTH）結(jié)構(gòu)域。

將百合LIMBFlc和其他植物的MBF1氨基酸序列，用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖3）顯示MBF1家族有2個分枝，第1類MBFl（Group I）包括a亞型（Subtype a）與b亞型（Subtype b）;c亞型（Subtype c）與a、b亞型相似度較低，歸屬第Ⅱ類MBFl（GroupⅡ）。百合LIMBFlc歸屬于c亞型，與油棕（Elaeis guineensis）的親緣關(guān)系最近，BLAST的結(jié)果顯示相似度達(dá)79%。

2.3 百合LIMBFlc亞細(xì)胞定位

利用基因槍將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pCAM-BIA1300-LIMBFlc-GFP轟擊到經(jīng)過24h預(yù)培養(yǎng)的洋蔥表皮細(xì)胞中，分別置于常溫、熱脅迫條件下暗培養(yǎng)24h后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果（圖4）表明，常溫下，空載對照pCAMBIA1300-GFP的綠色熒光分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;熱脅迫下，綠色熒光的分布無明顯變化。常溫下，pCAMBIA1300-LIMBF/c-GFP的綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;熱脅迫下，pCAMBIA1300-LIMBFlc-GFP的綠色熒光則主要分布在細(xì)胞核中。表明LIMBFlc可能介導(dǎo)了熱激信號由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細(xì)胞核內(nèi)進一步行使功能。

2.4 百合LIMBFlc的表達(dá)分析

利用實時熒光定量PCR檢測了LIMBFlc的時空表達(dá)。結(jié)果表明，常溫條件下，LIMBFlc在百合根、鱗莖和葉中均有表達(dá)，其中葉中的表達(dá)量最高，根中次之，鱗莖中最低（圖5）。熱激處理后，在0.5～8.0h內(nèi)百合葉片中LIMBFlc的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但始終高于對照，在熱激處理2h時達(dá)到峰值，為對照的5.53倍（圖6）。常溫條件下，與對照相比.CaCl2或EGTA處理的//MBFlc的相對表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。37℃熱脅迫下，CaCl，處理顯著促進了LIMBFlc的表達(dá)（P<0.05），而EGTA處理則顯著抑制了LIMBFlc的表達(dá)（P<0.05）（圖7），表明LIMBFlc也可能通過Ca2+信號途徑參與百合的熱激反應(yīng)。

3 討論

目前，有關(guān)百合的耐熱研究主要集中在以下幾個方面：（1）百合對高溫脅迫的形態(tài)和生理響應(yīng)。（2）百合種質(zhì)耐熱性比較。（3）利用物理、化學(xué)方法或雜交育種途徑提高百合的耐熱性[18-23]。（4）百合響應(yīng)高溫脅迫的分子機制。百合LIHSFA1、LIHsfA2、LIHSP70、LimHSP16.45的表達(dá)受高溫誘導(dǎo)，在擬南芥中過表達(dá)這些基因顯著提高了植株的耐熱性。百合鈣調(diào)蛋白LICaM3為響應(yīng)Ca2+和熱脅迫的重要信號分子，Ca2+/LICaM3可能在HSFA1的上游發(fā)揮作用。尚愛芹等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將擬南芥干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白At-DREB2A（Dehydration responsive element binding pro-tein 2A）基因轉(zhuǎn)化百合，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD等酶活性及脯氨酸含量高于野生型植株，耐熱性明顯強于野生型植株。以上的研究結(jié)果表明ROS、SA、HSF-HSP和Ca2+信號途徑均參與了百合耐熱性的調(diào)控。近年的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄輔激活因子MBF1涉及通過激素、HSF-HSP、ROS和Ca2+信號途徑調(diào)控植物的耐熱性，是植物熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，在植物耐熱性的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用。根據(jù)氨基酸序列的不同，植物中的MBF1可分為a、b、c3個亞型.a亞型與b亞型相似度較高，歸屬第1類MBFl;c亞型與a、b亞型相似度較低，歸屬第Ⅱ類MBFl。與I類MBF1相比，Ⅱ類（c亞型）MBF1在植物耐熱性的調(diào)控中起主要作用。因此，我們選擇植物熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的可能整合因子MBFlc作為研究對象。本研究以耐熱性較好的麝香百合雜種系品種白天堂為試驗材料，從中克隆了MBFlc基因。同源比對及系統(tǒng)進化樹分析的結(jié)果顯示LIMBFlc歸屬c亞型MBF1，具有典型的MBF1和HTH結(jié)構(gòu)域。

MBF1的結(jié)構(gòu)和功能在真核生物中高度保守：C-末端形成MBFlcTD。結(jié)構(gòu)域，為TBP的結(jié)合域，N-末端能夠結(jié)合激活蛋白，通過橋接通用轉(zhuǎn)錄因子TBP和基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，增強特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，促進依賴于該轉(zhuǎn)錄因子的基因的表達(dá)。雖然MBF1是一種核受體輔激活因子，但在常溫下，AtMBFlc主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，熱激則促進了它在細(xì)胞核中的表達(dá)。對LIMBFlc的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明LIMBFlc沒有明顯的跨膜區(qū)域，預(yù)測其主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)。進一步的亞細(xì)胞定位顯示熱脅迫增強了LIMBFlc在細(xì)胞核內(nèi)的相對表達(dá)，表明LIMBFlc可能介導(dǎo)了熱激信號由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細(xì)胞核內(nèi)進一步行使轉(zhuǎn)錄輔激活功能，這與對小麥TaMBFlc的研究結(jié)果類似。葡萄VvMBFlc、大麥HvMBFlc、芥藍(lán)MBFlc、擬南芥AtMBF lc、小麥TaMBFlc受熱激誘導(dǎo)表達(dá)，小麥Ta MBFlc啟動子區(qū)域包含HSE響應(yīng)元件。本研究中，37℃熱脅迫顯著促進了百合LIMBFlc的表達(dá)，LIMBFlc基因啟動子克隆及其響應(yīng)元件分析工作正在進行中。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及調(diào)控百合的耐熱性，有研究結(jié)果表明MBFlc的表達(dá)也受Ca2+信號系統(tǒng)的調(diào)控，因此我們研究了CaCl2、鈣離子螯合劑EGTA處理對LIMBFlc表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)LIMBFlc的表達(dá)受熱脅迫與Ca2+處理協(xié)同誘導(dǎo)，表明LIMBFlc也可能通過Ca2+信號途徑參與百合的高溫脅迫反應(yīng)。亞細(xì)胞定位與基因表達(dá)的結(jié)果表明LIMBFlc可能參與了百合的熱激響應(yīng)。

近年來的研究結(jié)果進一步揭示了MBFlc調(diào)控植物耐熱性的機制。AtMBFlc能夠結(jié)合CTAGA元件，調(diào)控DREB2A和HSFB的表達(dá)來增強擬南芥的耐熱性，AtMBFlc還可以與海藻糖磷酸合成酶AtTPS5（Trehalose phosphate synthase 5）或脅迫相關(guān)蛋白AtSAP5（Stress-associated protein 5）互作，由此提高植株海藻糖的含量或HSP基因的表達(dá)量來增強擬南芥的耐熱性。超表達(dá)小麥TaMBFlc水稻植株中6個HSP基因和2個TPS基因的表達(dá)量顯著高于野生型，具有較好的耐熱性。LIMBFlc能否真正調(diào)控百合的耐熱性，需要進一步分析基因的功能。