曹麗萍 杜金梁 賈睿 殷國俊 Galina Jeney 丁煒東 高崧

摘要：以四氯化碳（CC14）構(gòu)建建鯉體內(nèi)急性肝損傷模型，對姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合護肝作用進行研究。分別采用含有姜黃素、甘草次酸、香菇多糖和低、中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合中草藥的飼料投喂60d后，各組建鯉腹腔注射30%CC14，注射劑量為每lg魚體注射0.005ml，禁食72h，以誘導(dǎo)建鯉急性肝損傷。通過測定各組建鯉生長指標(biāo)、血清和肝臟生化指標(biāo)及肝組織炎性細胞因子mRNA的表達情況，觀察姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥的保肝效果。結(jié)果顯示：甘草次酸單味用藥及中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥能顯著提高建鯉的相對增重率和特定生長率，顯著降低餌料系數(shù);與模型組相比，各用藥組能顯著抑制CC14導(dǎo)致的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的升高，顯著恢復(fù)肝組織中谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，抑制丙二醛（MDA）生成，能顯著抑制C-Rel，iNOS、IL-Iβ、TNF-a、IL-6和IL-8表達量的升高;與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥的保肝效果更明顯，隨著聯(lián)合用藥劑量的升高，作用愈加顯著。說明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥，對CC14誘導(dǎo)的建鯉肝損傷具有協(xié)同保護作用。

關(guān)鍵詞：建鯉;四氯化碳;肝損傷;中草藥

中圖分類號：S948

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1100-07

中藥姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma lon，-gaL.）的干燥根莖，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有廣泛的藥理作用。姜黃素（Curcumin）是中藥姜黃的主要活性成分，是唯一一種具有酚基和醌基的天然藥物，毒性低，耐受性好，具有較強的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝及免疫調(diào)節(jié)等活性，且無明顯的毒副作用，是常用傳統(tǒng)中藥。甘草次酸（Glycyr-thetinic acid，GA）是甘草的重要成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝等廣泛的藥理學(xué)作用。香菇多糖（Lentinan，LNT）是從擔(dān)子菌綱香菇中提取的一種B-D-（1，3）葡萄糖殘基為主鏈、（1，6）葡萄糖殘基為側(cè)鏈的葡聚糖，具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和促進干擾素生成等功能。

臨床上，利用不同中藥聯(lián)合用藥治療疾病是中醫(yī)用藥的特色和優(yōu)勢。聯(lián)合用藥的優(yōu)勢一方面是中藥基本性能發(fā)揮作用，另一方面是各個組成藥物之間的協(xié)同放大作用。復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合水飛薊素治療藥物性肝病的效果明顯優(yōu)于單味用藥。五味子與黃芪多糖協(xié)同作用，能顯著提高乙酰氨基酚致肝損傷小鼠谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）水平，減輕肝組織損傷程度。鑒于姜黃素、甘草次酸和香菇多糖的保肝和免疫調(diào)節(jié)功效，本研究以CC14誘導(dǎo)建鯉肝損傷，并建立急性肝損傷模型，通過檢測建鯉生長指數(shù)、血清和肝臟組織勻漿中相關(guān)生化指標(biāo)及細胞因子mRNA表達的變化，研究姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥對建鯉急性肝損傷的保護作用，探討這3種中藥配伍的合理性和科學(xué)性，為進一步開發(fā)魚類保肝中草藥配方奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗魚

建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質(zhì)健康無傷，規(guī)格基本一致，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中。馴養(yǎng)條件為：（27±2）℃，pH6.8～7.6，溶解氧（DO）質(zhì)量濃度>5mg/L，NH3質(zhì)量濃度<0.05mg/L，H2S質(zhì)量濃度<0.01mg/L。每天投喂普通飼料（粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21kl/g）2次，每次投喂飼料量為魚體質(zhì)量的2%，馴養(yǎng)7d。

1.2 主要藥品與儀器

姜黃素、甘草次酸購自Sigma公司，香菇多糖粗制粉購自無錫正大畜禽有限公司。CC14（分析純）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，配置成30%的CC1。一橄欖油溶液（CC14：橄欖油=3：7，體積比）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量測定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。DuGreen核酸染料（10000x水溶液）購自碩世生物科技有限公司，總RNA抽提試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自于TaKaRa公司。MK3酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品，ABI-7500型PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 試驗設(shè)計

初體質(zhì)量為（30.0+1.0）g的健康鯉魚，飼養(yǎng)于淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭基地700cmx435cmX120cm的室內(nèi)水泥池內(nèi)。隨機分為8組，每組20尾，分別為空白對照組、模型對照組（CC14）、姜黃素組（5.0g/kg姜黃素）、甘草次酸組（3.0g/kg甘草次酸）、香菇多糖組（3.0 g/kg香菇多糖）、聯(lián)合藥物低劑量組（1.0g/kg姜黃素+1.0g/kg甘草次酸+1.0g/kg香菇多糖）、聯(lián)合藥物中劑量組（2.5 g/kg姜黃素+1.5g/kg甘草次酸+1.5g/kg香菇多糖）和聯(lián)合藥物高劑量組（5.0g/kg姜黃素+3.Og/kg甘草次酸+3.0g/kg香菇多糖）。其中，空白對照和模型對照組均投喂普通飼料，其他各藥物組分別投喂含相應(yīng)劑量中藥的飼料。每天投喂2次，每天記錄投喂餌料量，每天投喂量約為魚體質(zhì)量的2%，共投喂60 d。投喂結(jié)束后，空白對照組腹腔注射橄欖油，模型對照組和各藥物組腹腔注射30%的CC14，注射劑量為每10g魚體注射0.05ml。禁食72 h，以誘導(dǎo)肝損傷。MS-222麻醉，各組稱質(zhì)量、采集血液和肝組織。

1.4 香菇多糖的制備及純度測定

香菇多糖粗制粉的制備采用水煮醇沉法，略加修改。稱取香菇多糖粗制粉100g加于100ml無菌水中，100℃水浴加熱溶解30 min，待完全冷卻后，350g、20℃離心10min，棄沉淀。上清液用無水分析乙醇沉淀至終濃度為80%，靜置過夜。次日，用2層紗布濾出沉淀，并用無水乙醇洗滌沉淀2～3次。40℃烘箱中烘干沉淀，干燥后研磨過篩，備用。

采用Dubotls法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中多糖的含量。精密稱取105℃干燥恒質(zhì)量的葡萄糖10mg，置于100ml容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分置于試管中，各加蒸餾水使體積為2.0ml，再各加5%的苯酚1.0 ml，搖勻，滴加濃硫酸5.0ml，搖勻放置10min.置沸水浴中加熱15 min.冷卻，同時另取蒸餾水2.0ml，同上操作為空白對照。在490nm處測定吸光度，以濃度和吸光度為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=1.021 9+1.722 5x，R2=0.999。精密稱取2mg香菇多糖提純樣品，溶解后按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定的吸光度值為2.638，以回歸方程計算出樣品中葡萄糖含量為93.82%。

1.5 生長指標(biāo)的測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，按照以下公式，計算每組魚相對增質(zhì)量率、特定生長率和餌料系數(shù)。相對增質(zhì)量率（RWR）=（Wt- Wo）/Wo×100%，特定生長率（SGR]=（InW- In Wo）/￡xl00%，餌料系數(shù)（FCR）=F/（W- WO）×100%，其中，Wt為終體質(zhì)量，Wo為初始體質(zhì)量，t為投喂時間，F(xiàn)為投喂飼料量。

1.6 血清生化指標(biāo)的測定

試驗結(jié)束后，用一次性注射器采集魚尾靜脈血。各組血液樣品4℃靜置2h后，3000 r/min、4℃離心15min分離血清，-20℃保存，備用。按照試劑盒操作說明分別測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和乳酸脫氫酶（LDH）活性。

1.7 肝組織勻漿生化指標(biāo)的測定

將抽完血的魚進行解剖，在肝臟右中葉相同部位取肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗血液，剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織，再用濾紙吸去表面水分，稱質(zhì)量，用眼科剪刀剪碎，移人勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水（體積分?jǐn)?shù)為0. 86%）進行勻漿。該勻漿以2 000r/min離心15min，收集上清液，備用。按照試劑盒操作說明分別測定肝勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和丙二醛（MDA）含量。

1.8 肝組織中NF-kB /C-Rel、iNOS、IL-lβ、TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表達水平測定

鯉魚處死后，剖取適量肝組織，參照RNAiso Re-agent說明書提取總RNA。采用紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度，以O(shè)D260/OD280值達到1.8～2.0作為合格標(biāo)準(zhǔn)。以O(shè)ligo（dT）18為引物進行RT反應(yīng)，合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)按照TaKaRa公司生產(chǎn)的ExScript TM RT-PCR Kit（Per-fect Real Time：SYBR Green I）說明書進行。基因特異引物及內(nèi)參β-actin，引物分別按照鯉NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、//-6、//-8和p-actin，基因序列采用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計（表1）。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS15軟件包中的單因素方差分析（one-way-ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對肝損傷建鯉生長指標(biāo)的影響

60 d的試驗結(jié)果（表2）顯示：與對照相比，甘草次酸單味用藥及中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥能顯著提高建鯉的相對增質(zhì)量率和特定生長率（P<0.05），顯著降低餌料系數(shù)（P<0.05），姜黃素、香菇多糖單味用藥及低劑量聯(lián)合用藥的效果不明顯（P>0.05）：與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對這3個生長指標(biāo)有顯著作用（P<0.05），隨著聯(lián)合用藥組劑量的升高，效果愈加明顯。

2.2 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對肝損傷建鯉生化指標(biāo)的影響

圖1顯示：30% CCI4-橄欖油腹腔注射建鯉后72 h，血清中GOT、GPT和LDH活性均顯著性高于空白對照組（P<0.05）;各個用藥組與CC14對照組相比較，血清中GOT、GPT和IDH活性均顯著下降（P<0.05）;與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥組相比較，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對恢復(fù)血清中的GOT、GPT和LDH活性有顯著作用（P<0.05），隨著聯(lián)合用藥劑量的升高，協(xié)同作用愈加明顯。

從圖2可見.30% CC14一橄欖油腹腔注射建鯉后72 h.肝組織勻漿中GSH含量和SOD活性均顯著低于空白對照（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）;與CC14對照相比，姜黃素、甘草次酸、聯(lián)合用藥均能顯著促進組織中SOD活性及GSH含量水平恢復(fù)（P<0.05），顯著抑制MDA生成（P<0.05），其中，香菇多糖組能顯著提高GSH水平，抑制MDA生成（P<0.05），但對SOD活性恢復(fù)沒有明顯作用（P>0.05）;與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對恢復(fù)肝組織中SOD活性和GSH水平及降低MDA含量有顯著作用（P<0.05），隨著聯(lián)合用藥劑量的升高，作用愈加顯著。

2.3 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對建鯉肝組織中炎性細胞因子表達的影響

為了考察中藥聯(lián)合用藥對建鯉肝組織中炎性細胞因子表達的影響，應(yīng)用實時定量PCR方法測定了NF-kB/C-Rel、iNOS、IL—lβ、TNF-a、IL-6和IL-8 mR-NA相對含量。結(jié)果（圖3）顯示，30%CC14一橄欖油腹腔注射建鯉后72 h，肝組織中炎性細胞因子的mRNA表達量與空白對照相比，均顯著升高（P<0.05）;與CC14對照組相比，姜黃素、甘草次酸、聯(lián)合用藥均能顯著抑制NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-α、IL-6和//-8表達量的升高（P<0.05）;與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對恢復(fù)肝組織中炎性細胞因子的mRNA水平有顯著作用（P<0.05），隨著聯(lián)合用藥劑量的升高，作用愈加顯著。

3 討論

CC14誘導(dǎo)建鯉肝組織損傷后，中間代謝產(chǎn)物過氧化三氯甲烷自由基（ CC1302·）通過攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化，損傷肝細胞，導(dǎo)致肝組織中的生化指標(biāo)發(fā)生變化。GPT、GOT和LDH是主要功能酶，肝細胞受損或壞死時，這些酶會進入血液，使血清中酶水平顯著提高。同時脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致SOD活性、GSH含量下降，MDA含量增加。本研究中采用30% CCI4-橄欖油腹腔注射建鯉后，發(fā)現(xiàn)姜黃素、甘草次酸、香菇多糖單味用藥及聯(lián)合用藥均可以降低CC14誘導(dǎo)的建鯉血清中酶活性和肝組織中MDA含量，恢復(fù)肝組織中SOD和GSH水平，說明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖不管是單獨使用還是聯(lián)合用藥均有保護肝組織的作用。研究結(jié)果還表明，姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥與3種中藥單獨使用相比較，降低肝損傷的作用更顯著，且具有劑量依懶性，說明三者聯(lián)合使用具有協(xié)同保護作用。

另一方面，CC1302·可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB，導(dǎo)致炎細胞大量釋放炎性介質(zhì)（例如細胞因子IL一1β、TNF-a、IL-6及IL-8等），介質(zhì)進一步活化中性粒細胞等炎細胞，通過級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致肝細胞變性死亡¨18-19]。抑制有關(guān)細胞因子的表達，可以有效降低肝損傷。本研究結(jié)果顯示，30% CCI4一橄欖油腹腔注射建鯉后，肝組織中NF-KB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、IL-6和IL-8 mRNA表達量顯著增加，而姜黃素、甘草次酸和香菇多糖均能抑制相關(guān)因子的表達上調(diào)，而聯(lián)合用藥的效果更為顯著，表明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖能通過抑制NF-KB/C-Rel的活化以及下調(diào)炎癥細胞因子的表達來降低CC14誘導(dǎo)的肝損傷，具有肝保護作用，3種藥聯(lián)合使用對抑制細胞因子表達具有協(xié)同作用。

臨床上，甘草被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方配伍里，甘草對增加溶解性，提高有效成分利用率，增強藥效和降低毒性有顯著作用。甘草次酸作為甘草的主要有效成分之一，也表現(xiàn)出與甘草類似的調(diào)和性質(zhì)。常明向等發(fā)現(xiàn)相較于姜黃素或甘草次酸單獨用藥，兩者聯(lián)合用藥藥效呈現(xiàn)相加或增強作用。周京輝等也發(fā)現(xiàn)，甘草次酸能加強姜黃素對HepG-2、MCF-7、A549癌細胞增殖的抑制作用，而且兩者在癌細胞的增殖抑制方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。這些發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果具有一致性，姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥對CC14誘導(dǎo)的建鯉肝損傷具有協(xié)同保護作用，這除了與它們自身的藥性作用有關(guān)外，可能還與甘草次酸的調(diào)和特性及香菇多糖能提高機體免疫力的作用有關(guān)，這也表明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥的合理性和科學(xué)性。