馬云昊，程珊，滕安國，張凱，王穩(wěn)航,2

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）（2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多、分布最廣且既有公共特點又有差異的一組結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在結(jié)締組織中起到支撐和保護(hù)機(jī)體的作用[1]。膠原分子為細(xì)棒狀，在顯微鏡下觀察膠原由原膠原按照規(guī)則平行排列成束，形成膠原微纖維，并進(jìn)一步聚集成束組成粗細(xì)不等的膠原纖維[2]。

膠原蛋白分子由于天然緊密的分子排列以及高的 長徑比（約 200）而具有高彈性模量和強(qiáng)柔韌度，從而使膠原蛋白成為制備既有優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度又有足夠延展性的生物材料的重要原料[3]。憑借著其優(yōu)良的成膜特性，膠原纖維既能用作人工皮膚等醫(yī)用膜，也能夠作為可食食品包裝膜，如可廣泛應(yīng)用于肉制品、油炸食品、煙熏食品、酸奶及食品配料等食品包裝上[4]。其中，邵東旭等利用魚鱗提取的膠原蛋白制備了復(fù)合抗菌膜并研究了其保鮮性能[5]；加拿大的Barbut[6,7]研究團(tuán)隊對膠原蛋白腸衣的性能進(jìn)行了全面評價；巴西研究人員以膠原纖維和膠原粉為原料成功制備了膠原蛋白膜并評價了其性能[8]；德國的Oechsle[9]等人率先研究了膠原纖維的酸溶脹機(jī)制，以及膠原與其它蛋白的相互作用。

就理化性質(zhì)而言，膠原蛋白為聚兩性電解質(zhì)[10]。在等電點時，膠原蛋白分子間疏水相互作用增大，其黏度、溶解度、電導(dǎo)率及膨脹作用都達(dá)到最低值；當(dāng)溶液pH偏離等電點時，蛋白質(zhì)分子上的正電荷或者負(fù)電荷基團(tuán)將增多，這使膠原蛋白間發(fā)生相互排斥從而增大膠原蛋白的溶解度[11]。對于不溶性的膠原纖維，其表現(xiàn)為酸堿膨脹現(xiàn)象，實質(zhì)為膠原肽鏈間的氫鍵、離子鍵以及共價鍵在酸堿的作用下發(fā)生破壞，使膠原結(jié)構(gòu)疏松。pH和離子強(qiáng)度不同帶來的溶解度以及膨脹性能的變化可能會引起膜性能改變，從而給膠原纖維膜的實際應(yīng)用帶來影響。這些因素具體的影響效果與相關(guān)機(jī)制，以及如何利用或避免這些外界條件的影響，需要進(jìn)行深入研究。

本文以牛二層皮來源的膠原纖維為成膜基料，通過配制不同pH和離子強(qiáng)度的膠原纖維成膜液，探討pH值和離子強(qiáng)度對膠原纖維膜性能的影響，同時本文也對干膜濕膜的機(jī)械性能進(jìn)行比較，以期為膠原蛋白膜的性能改善以及其應(yīng)用（如生產(chǎn)膠原蛋白腸衣）提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛二層皮（置于濃度為 10 wt%的堿石灰中浸泡30 d）購于山東省淄博龍寶生物有限公司；氯化鈉、鹽酸（均為分析純），天津市江天化工技術(shù)有限公司；NaH2PO4·2H2O（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠。

1.2 儀器與設(shè)備

測厚儀（CH-1-ST），上海六菱儀器廠；紫外可見分光光度計（SP-2102），上海光譜儀器有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT. Plus），Stable Micro System，UK；掃描電子顯微鏡（SU 1510），Hitachi，Japan；酸度計（PH-3CW），上海理達(dá)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛皮膠原纖維的提取及其懸浮液的制備

牛皮為經(jīng)堿石灰處理后的二層皮，pH值為12。將買回來的整張牛皮剪成10 cm×10 cm小塊，在蒸餾水中浸泡，每隔2 h換一次水，浸泡至pH為中性，然后取出瀝干浸沒在 0.01 mol/L的鹽酸中，牛皮:鹽酸=1:3（m/V），于 20 ℃下進(jìn)行充分酸溶脹 24 h。溶脹后的牛皮用鑷子輕輕刮取其膠原纖維，然后測定膠原纖維的水分含量為94%，即刮取的膠原纖維干物質(zhì)含量為 6%。將刮取的膠原纖維用研缽磨碎，均勻的分散在蒸餾水中，配置成1 wt%的膠原纖維懸浮液，再用打漿機(jī)將懸浮液剪切混勻，形成均勻的1 wt%懸浮液，然后利用鹽酸調(diào)節(jié)懸浮液的pH為2，并于4 ℃冰箱中儲存，以備后期使用。

1.3.2 不同pH的膠原纖維膜的制備

將配制好的1 wt%的膠原纖維成膜液倒入聚四氯乙烯（PFTE）平板（15 cm×15 cm）進(jìn)行鋪膜，隨后將平板置于盛有濃度為0.1 M 的NH3·H2O的密封箱中，利用 NH3·H2O 的揮發(fā)性調(diào)節(jié)膠原纖維成膜液的pH值，分別得到pH為2、3、5、7、11的成膜液。隨后將不同pH值的成膜液置于35 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥8 h，后將烘干后的膜從PFTE板中慢慢揭下，在相對濕度為50±1%的干燥箱中放置7 d后再進(jìn)行膜的性能檢測。

1.3.3 不同離子強(qiáng)度的膠原纖維膜的制備

將1 wt%膠原纖維懸浮液攪拌5 min后，倒入平板中進(jìn)行鋪膜，置于35 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干8 h，將樣品膜從平板上慢慢揭下，隨后將干膜完全浸泡到濃度分別為0.1，0.2，0.3 mol/L的NaCl溶液中，10 min后將膜輕輕取出，烘干后檢測干膜的性能。用 NaCl處理后的干膜于室溫下在蒸餾水中浸泡20 min后，再進(jìn)行濕膜性能的檢測。

1.3.4 膜性能的測定

1.3.4.1 膜厚度

選取膜上的4個邊緣處和中心點處，利用測厚儀測量膜厚，測厚儀的靈敏度為0.003 mm，測量范圍為0～1 mm。測量三次，選取平均值作為膜的厚度值。

1.3.4.2 機(jī)械性能

使用質(zhì)構(gòu)儀檢測復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度（TS）和斷裂延伸率（E%）。實驗步驟參照了ASTM D-882[12]的方法，將膜裁剪成6.0 cm×2.5 cm的矩形條狀，測試參數(shù)為：探頭：A/TG；測試速度：1 mm/s；初始夾距為30 mm。每組重復(fù)三次。計算公式如下：

式中：F-膜斷裂時承受的最大拉力，N；S-膜的橫截面積，mm2；TS-拉伸強(qiáng)度，MPa。

式中：E-膜的斷裂延伸率，%；L1-膜斷裂時受力部分的長度，mm；L0-膜的原長，mm。

1.3.4.3 微觀結(jié)構(gòu)

利用電子掃描電鏡（SEM）觀察復(fù)合膜的表面和斷面結(jié)構(gòu)，實驗方法參照Chen Ye[13]并稍作修改。加速電壓為15 kV。觀察膜的橫截面時，樣品膜置于液氮中進(jìn)行脆斷，裁剪成0.5 cm×0.5 cm小塊，粘貼在導(dǎo)電膠帶上。所有樣品膜進(jìn)行噴金后在電鏡下觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.4.4 膨脹動力學(xué)性能

根據(jù) Wang等人[3]的方法檢測膜的膨脹性能，計算樣品膜在室溫下于蒸餾水中浸泡1/12、1/2、1、2、3、6 h 前后膜的質(zhì)量。樣品膜裁剪為 5 cm×2 cm，并稱其重量為 Mw，隨后浸于蒸餾水中，然后利用濾紙將膜表面擦干，立即稱其重量為M0。每組樣品重復(fù)三次。樣品膜的平衡溶脹率（ESR）計算公式如下：

式中：ESR-平衡溶脹率，%；Mw-浸泡前膜重量，g；Mo-浸泡后膜重量，g。

1.3.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 厚度的測定

圖1 不同pH和離子強(qiáng)度下膠原纖維膜的厚度Fig.1 Thickness of collagen fiber film under various pH and ionic strength

從圖1中可以看出，經(jīng)不同pH處理后的膠原纖維膜的厚度沒有明顯變化（p＞0.05），厚度值在32.8±1.69～34.2±1.39 μm之間。當(dāng)pH=2 時，膠原纖維膜的厚度達(dá)到最大值33.4±1.37 μm。同時，隨著離子強(qiáng)度的增加（0.1～0.3 mol/L），膜的厚度顯著增加，最高值為38.0±0.71 μm，這主要是因為鹽濃度過高會引起鹽效應(yīng)作用，部分鹽離子在膜表面，致使電解質(zhì)對膠原纖維-膠原纖維間產(chǎn)生了電荷屏蔽作用，從而擾亂了膠原纖維之間的有序性[14]，從而使膜表面的粗糙度增加，影響膜厚度。

2.2 機(jī)械性能

圖2 不同pH和離子強(qiáng)度膠原纖維膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂延伸率Fig.2 Tensile strength and elongation at break of collagen fiber film under various pH and ionic strength

從圖2中（a）可以看出，當(dāng)pH值為2～3時，膠原纖維膜的拉伸強(qiáng)度沒有顯著變化，當(dāng)pH為3～5時膜的拉伸強(qiáng)度顯著降低（p＜0.05），最低達(dá)到15.43±1.47 MPa；此后隨著pH值的增加，拉伸強(qiáng)度顯著性增加。值得注意的是，當(dāng)pH=2時，膠原纖維的拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大，但是我們并沒有選取更低pH成膜液進(jìn)行測定，這是因為當(dāng)pH小于2時，膠原纖維極易降解，所成膜的穩(wěn)定性得不到保障，這對于實際應(yīng)用與科學(xué)研究的意義不大。此外，隨著離子強(qiáng)度增加，膠原纖維干膜和濕膜的拉伸強(qiáng)度均顯著降低（p＜0.05）：當(dāng)鹽濃度為 0.1 mol/L時，膜的拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大為83.40±3.11 MPa，隨著離子強(qiáng)度的增加二者均顯著性下降。同時，由圖（b）可知，pH對膠原纖維膜斷裂延伸率的影響和其對拉伸強(qiáng)度的影響趨勢相似，而隨著離子強(qiáng)度的增加干膜和濕膜斷裂延伸率均顯著性降低。此外，從圖2可以看出，膠原纖維干膜經(jīng)蒸餾水浸泡20 min后，得到濕膜的拉伸強(qiáng)度與斷裂延伸率顯著性增加（p＜0.05）。

這種現(xiàn)象可以解釋為：（1）pH影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及分子間相互作用。從牛皮中提取的膠原纖維的等電點約為5.0～7.5[15]，當(dāng)膠原纖維處于等電點時，整個分子為電中性，其分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)卷曲狀態(tài)，纖維之間作用力減少，此時膠原纖維膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂延伸率較低；當(dāng)pH高于或低于等電點時，因膠原纖維之間的靜電斥力，使分子伸展，內(nèi)部基團(tuán)暴露，增加分子之間交聯(lián)度，促進(jìn)膠原纖維膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，致使拉伸強(qiáng)度和斷裂延伸率增加。

（2）電解質(zhì)的加入增強(qiáng)了膠原之間的靜電斥力，分子鏈中的基團(tuán)暴露，增強(qiáng)了膠原纖維之間的交聯(lián)作用。此外，膠原基團(tuán)還會與中性鹽離子結(jié)合形成離子鍵，增強(qiáng)了分子間的作用力[16]；而鹽離子濃度過高，鹽效應(yīng)起主要作用，電解質(zhì)對膠原纖維產(chǎn)生屏蔽作用，使纖維間的作用力降低。（3）經(jīng)蒸餾水浸泡后，膠原纖維自身含有親水性基團(tuán)（如-COOH）與水分子的作用增強(qiáng)，破壞了纖維與纖維之間的氫鍵，導(dǎo)致膠原纖維分子間的作用力減弱，相互之間的交聯(lián)作用降低，致使?jié)衲づc干膜相比，斷裂延伸率與拉伸強(qiáng)度均降低。

2.3 微觀結(jié)構(gòu)

圖3 膠原纖維膜表面和橫斷面的SEM圖Fig.3 SEM images of surface and cross section of collagen fibers film under different pH and ionic strength

如圖3所示，純膠原纖維膜和pH=2時的膠原纖維膜表面相對光滑，質(zhì)地均一，這主要是由于膠原纖維處于等電點時，纖維呈現(xiàn)出卷曲狀態(tài)，而偏離等電點時，由于靜電斥力的作用使纖維之間交聯(lián)作用增強(qiáng)，分子之間交織排列整齊有序。a～c和d～f顯示了不同鈉離子強(qiáng)度對膠原纖維膜的表面和相應(yīng)橫斷面微觀結(jié)構(gòu)的影響。從圖a～c中可以看出，隨著鈉離子強(qiáng)度增加，膜表面的粗糙度顯著增加。當(dāng)離子強(qiáng)度為 0.1 mol/L時，膜的表面（a）光滑，對應(yīng)的橫截面（d）比較致密，膠原纖維之間相互交織排列有序；而后隨著鹽離子濃度的增加，膜表面出現(xiàn)凸起的纖維絲，導(dǎo)致表面粗糙度增加；當(dāng)離子強(qiáng)度為0.3 mol/L時，膜表面出現(xiàn)了鹽析現(xiàn)象，這主要是因為鹽離子濃度過高（≥0.2 mol/L）時，電解質(zhì)對膠原纖維產(chǎn)生了電荷屏蔽作用，導(dǎo)致纖維與纖維之間的靜電斥力減弱，纖維之間的相互作用力降低，從而影響了纖維的穩(wěn)定性，纖維之間形成雜亂無序的結(jié)構(gòu)（如圖f）。這也充分說明了當(dāng)離子強(qiáng)度過高時纖維間內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性被破壞，此結(jié)果也與機(jī)械強(qiáng)度的測定結(jié)果一致。

2.4 膨脹動力學(xué)性能

圖4 離子強(qiáng)度對膠原纖維膜的膨脹動力學(xué)性能的影響Fig.4 Influence of ionic strength on the swelling kinetics properties of collagen films

為了進(jìn)一步研究鹽濃度和成膜液的pH對膠原纖維膜的性能的影響，分析了不同離子強(qiáng)度與不同 pH下生成的膠原纖維膜在蒸餾水中浸泡不同時間（5、30、60、120、180和360 min）前后的質(zhì)量比，計算出膠原纖維膜的平衡溶脹率（ESR）。如圖4、圖5所示，所有的膜在蒸餾水中浸泡30 min內(nèi)快速吸水，膜的平衡溶脹率顯著性增加，此后吸水能力增加緩慢，直到360 min后溶脹率達(dá)到平衡。

從圖4可以看出，隨離子強(qiáng)度的升高，膜的膨脹性能逐漸升高；由圖5可以看出，當(dāng)成膜液的pH在膠原纖維等電點附近時，膠原纖維的膨脹性較小，而隨著偏離等電點，膠原纖維的膨脹性逐漸升高。實際上，膜在水溶液中的膨脹性能主要依靠其分子內(nèi)部的親水基團(tuán)和膜的有效交聯(lián)度[3]。當(dāng)處于等電點時，膠原纖維之間分子間作用力較大，有相互聚集的趨勢，所以此時膜的膨脹率相對較低；此外，在鹽溶液中膠原肽鏈間的離子鍵被打開，從而吸水膨脹，致使膠原纖維與水分子間的作用力增大，導(dǎo)致膠原纖維間的分子作用力減少，膜的機(jī)械性能也會因此降低。這些結(jié)果與機(jī)械性能測定的結(jié)果一致。

圖5 成膜液pH對膠原纖維膜的膨脹動力學(xué)性能的影響Fig.5 Influence of the pH of the film forming solution on the swelling kinetics properties of collagen films

3 結(jié)論

本文研究了pH和離子強(qiáng)度對膠原纖維膜性能影響。研究表明，在酸性及低離子強(qiáng)度條件下膠原纖維膜展現(xiàn)出較好機(jī)械性能。pH對膠原纖維膜厚度沒有顯著影響，當(dāng)pH值偏離等電點越遠(yuǎn)，膜的機(jī)械性能越高，微觀結(jié)構(gòu)顯示等電點時膜表面光滑，高于或低于等電點時膜比較粗糙。隨著離子強(qiáng)度增加，膜的厚度顯著性增加，且無論干膜還是濕膜，膜機(jī)械性能均隨著離子強(qiáng)度增加而顯著降低，與干膜相比，所有濕膜的拉伸強(qiáng)度均發(fā)生巨大降低，而斷裂延伸率卻大幅度增加；此外，膨脹性能隨離子強(qiáng)度及成膜液偏離等電點程度增加而增加。綜上所述，適當(dāng)?shù)统赡ひ弘x子強(qiáng)度以及低pH有利膠原纖維膜性能增強(qiáng)，這于膠原纖維膜在食品可食性包裝等方面的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。