田 燕，劉 琦，張成鴻，高 萌，金 越，徐 紅，李慶偉

(1. 遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學藥學院，遼寧大連 116044； 3. 大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，遼寧大連 116044)

原發(fā)性肝癌是世界上癌癥致死率排在第3位的惡性腫瘤[1-2]，但目前治療肝癌的方法有限。采用納米粒(nanoparticles, NPs)等靶向給藥系統(tǒng)、提高化療藥物的靶向性是目前一種常見的肝癌治療手段[3]。大黃素(emodin, EMO)是中藥大黃、何首烏等的重要有效單體，具有抗菌消炎、肝臟保護、抗癌等藥理作用[4-6]，但以EMO為主要成分并投入臨床治療的制劑較少，主要是因為其結構中含有較多的游離酚羥基、不穩(wěn)定，又由于其在水中的溶解性較差、口服生物利用度較低，限制了其在臨床中的應用。本研究將EMO制成納米粒，通過材料的包載作用，可提高EMO的體外穩(wěn)定性，并通過控制粒徑大小使其被動靶向到肝臟，更好的發(fā)揮對肝癌的治療作用[7]。

納米粒載體材料的選擇是制備納米粒的關鍵因素之一，其中乙交酯丙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)是目前研究和應用較為成熟的合成高分子材料，有可靠的生物相容性、無免疫原性及可生物降解、無毒性[8]。維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是納米粒制備過程中的高效乳化劑，有提高疏水性藥物吸收、加強抗腫瘤藥物的滲透性和吸收性等優(yōu)點[9-10]。因此，本課題組將二者通過酯化反應合成新的高分子材料乙交酯丙交酯共聚物-琥珀酰基維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(polylactide-co-glycolide succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, PLGA-STPGS)，可通過控制納米粒的粒徑，實現所載藥物對肝臟的被動靶向作用，由于TPGS是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的抑制劑及其較好的水溶性[10]，可使藥物在腫瘤細胞中更好的發(fā)揮治療作用。

本研究在此基礎上，以EMO為模型藥物，以PLGA-STPGS為載體材料，通過乳化溶劑揮發(fā)法制備大黃素PLGA-STPGS納米粒(emodin-loaded PLGA-STPGS nanoparticles, EPTN)，并以市售材料PLGA為對照制備大黃素PLGA納米粒(emodin-loaded PLGA nanoparticles, EPN)，測定二者粒徑、載藥量(drug loading, DL)和包封率(entrapment efficiency, EE)；選擇人肝癌細胞HepG2為模型細胞，將2種NPs分別在體外與HepG2細胞孵育24 h和72 h，再用膜聯蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(annexin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染試劑盒和原位凋亡檢測試劑盒(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labelling, TUNEL)檢測凋亡的細胞，以評價EPTN在體外誘導HepG2細胞凋亡的效果。

1 材料與方法

1.1試劑大黃素(純度97%，美侖生物公司，批號J0510A)；TPGS(MBWB1500，美國Eastman化學公司，批號：09060025)；PLGA(50∶50；MBWB40 000，山東省醫(yī)療器械研究所，批號：16042609)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20170519)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20161123)；其他所用試劑均為分析純。

1.2細胞株人肝癌HepG2細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。

1.3儀器XS105DU電子天平(梅特勒托利多有限公司，瑞士)；Olympus CKX41熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrophotometer, FTIR，Bruker Optics公司，德國)；AVANCEIII HD1H-核磁共振光譜儀(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR，400M，Bruke公司，瑞士)；Milford凝膠滲透色譜儀(Gel permeation chromatography, GPC，Waters公司，美國)；NanoZS90激光粒徑儀(Marlvern公司，英國)；BD FACSAria II流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.4PLGA-STPGS的合成精密稱取TPGS 300 mg(0.2 mmol)和丁二酸酐50 mg(0.5 mmol)于燒瓶中，加二氧六環(huán)溶解。加入一定量的4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)為催化劑，在60 ℃反應24 h。將產物加入適量石油醚產生白色沉淀，真空干燥48 h，得白色粉末為琥珀?；S生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, STPGS)。精密稱取PLGA 200 mg(0.005 mmol)和適量的STPGS(0.005 mmol)于燒瓶中，加適量二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)溶解。用甲烷磺酸為催化劑，90 ℃反應24 h。將產物加入適量無水乙醇得到白色沉淀，并用純化水反復洗至無反應物和溶劑殘留，冷凍干燥24 h，得白色粉末PLGA-STPGS(合成過程見圖1)。

1.5PLGA-STPGS的表征精密稱取PLGA、TPGS與PLGA-STPGS各1 mg，分別用溴化鉀100 mg壓片，用FTIR法測定產物的紅外光譜；同時以氘代氯仿(Chloroform-d, CDCl3)為溶劑測定3種聚合物的氫核磁共振譜(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)來確定產物的分子結構；采用GPC法測定PLGA-STPGS的數均分子量和分子量分布，流動相為四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)，流速為1 mL/min，進樣量為50 μL[樣品濃度為0.1%(W/V)]。采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)評價3種聚合物的熱性能，量取3種樣品各5 mg置于鋁坩堝中，以10 ℃/min的速度將溫度從30 ℃逐漸升高到390 ℃進行測定。

1.6納米粒的制備精密稱取PLGA和PLGA-STPGS各100 mg，EMO 30 mg，用適量乙酸乙酯使其全部溶解，滴加到120 mL 0.5 g/L的TPGS水溶液中，在150 W超聲條件下超聲4 min，形成乳濁液。再將乳濁液于室溫下600 r/min電動攪拌24 h，充分揮發(fā)乙酸乙酯后20 000 r/min高速離心15 min，然后將沉淀物用適量去離子水反復洗至上清液無EMO殘留(將上清液吸出后滴加適量20 g/L的FeCl3水溶液至不顯色為止)，每次均用20 000 r/min高速離心15 min，所得沉淀物再用少量去離子水分散均勻后冷凍干燥24 h，得淡黃色EPN及EPTN，4 ℃儲存?zhèn)溆?。以PLGA-STPGS為載體，同法制得不含EMO的白色空白納米粒(blank PLGA-STPGS nanoparticles, BPTN)。

1.7納米粒的表征

1.7.1粒徑和ζ-電位的測定 稱取干燥好的EPTN、EPN適量，用25 g/L的磷鎢酸溶液進行負染，置透射電鏡下觀察2種NPs的形態(tài)特征。另稱取干燥好的EPTN、EPN適量，超聲分散后形成納米?；鞈乙海眉す饬６葍x對其粒徑、粒徑分布和納米粒表面的ζ-電位進行測定。

圖1PLGA-STPGS的合成途徑示意圖

Fig.1 Illustration of the synthesis of PLGA-STPGS copolymer

1.7.2EMO色譜條件的建立 色譜柱為Kromasil ODS1(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為287 nm，流動相為甲醇-0.5%冰乙酸溶液(90∶10)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。分別精密稱取EMO原料藥、對照品、EPN和EPTN適量，EMO溶解于甲醇中，EPN及EPTN溶解于乙酸乙酯中后用氮氣吹干，再加入甲醇溶解定容至25 mL(質量濃度為12 μg/mL)，取適量進樣。反相高效液相色譜圖(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)見圖2，EMO的保留時間約為14.0 min，在此條件下，理論板數以EMO計不低于2 000，分離度符合要求。

圖2大黃素反相高效液相色譜圖

Fig.2 RP-HPLC images of EMO

A：EMO對照品；B：EMO原料藥；C：EPTN；D：EPN。1：EMO。

1.7.3EMO標準曲線的繪制 精密稱取EMO對照品10 mg，以甲醇為溶劑配制濃度為500 μg/mL的EMO對照貯備液。依次從中精密量取60、120、240、480、960 μL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得EMO系列對照品溶液(質量濃度為3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL)。按照1.7.2項下色譜條件，取EMO系列對照品溶液分別進樣3次，以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，得標準曲線方程：A=81.998 2C+54.568 1(r=1.000 0)。結果表明，EMO在3.0～48.0 μg/mL之間線性關系良好。

1.7.4載藥量和包封率的測定 精密稱取同一批號的EPN 2.1 mg和EPTN 1.4 mg各6份，按1.7.2項下操作，測定峰面積A，計算樣品中EMO含量，再根據以下公式(1)、公式(2)計算EPN和EPTN的DL和EE。

公式(1)

公式(2)

1.8誘導HepG2細胞凋亡的測定選取對數生長期的HepG2細胞，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度(5×105/mL)后用6孔板培養(yǎng)細胞24 h。細胞貼壁后，吸去各孔培養(yǎng)液，以5-氟尿嘧啶溶液(5-fluorouracil solution, FS, 20 μg/mL)為陽性對照組，分別加入EMO濃度為20 μg/mL的EPTN、EPN混懸液、材料濃度為72.5 μg/mL的BPTN混懸液(與EPTN混懸液中PLGA-STPGS濃度相同)和EMO溶液(emodin solution, EMS, 20 μg/mL)，各組藥物溶液均用無血清的H-DMEM培養(yǎng)基溶解、納米粒均用無血清的H-DMEM培養(yǎng)基超聲分散均勻，每組3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、72 h后，分別收集每孔細胞并用冷的PBS緩沖液沖洗3次，重新分散在結合緩沖液(binding buffer)中使?jié)舛葹?×106/mL，按照試劑盒說明書操作，分別加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI 5 μL，混勻，避光孵育20 min后，加入結合緩沖液400 μL，輕輕吹散細胞并用紗布過濾，立即用流式細胞分析儀分析細胞的凋亡特性。

將待測細胞接種于48孔板中(1×104/mL)并培養(yǎng)24 h，實驗分為陽性對照組(加入TUNEL細胞凋亡試劑盒配備的DNA內切酶Ⅰ)、BPTN、FS組、EMS組、EPN和EPTN混懸液組，每組3個復孔，藥物濃度及處理方法同上。繼續(xù)培養(yǎng)24、72 h后，按照TUNEL細胞凋亡試劑盒說明書操作，37 ℃避光孵育30 min后，將所有孔內液體吸走，用冷PBS洗3次，每次5 min。將500 ng/mL的4′，6-二咪基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)100 μL加入到各孔細胞中，染色15 min。用PBS洗3次，每次5 min，立即在倒置熒光顯微鏡(fluorescence inversion microscope, FIM)下觀察各孔細胞的凋亡情況。

2 結 果

2.1PLGA-STPGS的表征由IR結果(圖3)可見，3種聚合物的主要吸收峰是在3 500～3 000 cm-1的OH鍵，在2 864～2 943 cm-1范圍是-CH2鍵引起的吸收。三者在1 724 cm-1處均有羰基吸收，但因PLGA與PLGA-STPGS分子中有較多的乳酸和羥基乙酸基團，故羰基吸收峰強度遠遠大于TPGS的羰基吸收。另外，三者在1 191 cm-1附近均有C-O引起的伸縮振動峰，由FTIR光譜證明PLGA-STPGS是不同于PLGA和STPGS的新的共聚物。1H-NMR測定結果見圖4。信號5.15 ppm和1.52 ppm(峰b和e)分別是PLA片段中-CH和-CH3，4.75 ppm(峰c)是PGA片段中CH2質子信號。3.78 ppm(峰d)是TPGS分子中聚氧乙烯片段上的-CH2信號。8.09(峰a)是聚乳酸片段中游離羧基-COOH上的質子信號。1H-NMR譜中PLGA-STPGS的數均分子量可以用質子信號分別在5.15(峰面積3.16)、4.75(峰面積6.44)和3.78 ppm(峰面積1.62)的峰面積比值進行計算，結果為24 114。PLGA和TPGS在整個聚合物中的比例分別為93.45%和6.55%。GPC測得PLGA-STPGS的數均分子量和分散度分別為25 347和1.42，與用1H-NMR測得的結果相似。PLGA和TPGS的熔融吸熱峰分別為316 ℃和45 ℃，而PLGA-STPGS的熔融吸熱峰為321 ℃(圖5)。以上結果進一步表明，PLGA-STPGS與PLGA、TPGS不同，是一個新合成的高分子材料。

2.2EMO納米粒的表征掃描電鏡測定結果見圖6，2種NPs均呈類球狀或球狀，表面圓整，且粒子大小均勻、粒子間分散無粘連。用激光粒度儀測定EPN的粒徑、多分散系數(polydispersity index, PDI)、ζ-電位和DL、EE結果見表1。結果表明，以自制材料PLGA-STPGS為載體制備的EPTN比用市售材料PLGA制備的EPN粒徑更小、分布更均勻，具有更大的DL和EE(P<0.05)。

圖3PLGA、TPGS與PLGA-STPGS的IR圖

Fig.3 FTIR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3誘導HepG2細胞凋亡的情況

2.3.1Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測結果 流式結果如表2所示，FS組中細胞凋亡、壞死含量相對較低；而經EMS和載EMO納米粒作用后，隨著培養(yǎng)時間的延長，誘導產生的細胞凋亡率不斷增加，呈時間依賴性。與EMS相比，EMO納米粒誘導細胞的凋亡率更高，且EPTN的凋亡率大于EPN。細胞孵育24 h后，EPTN和EPN誘導細胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(28.1%)分別提高了19.1%(P=0.042)和13.5%(P=0.046)，且相比FS的凋亡率(17.8%)分別提高了29.4%(P=0.029)和23.8%(P=0.031)；72 h后，EPTN和EPN誘導細胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(30.9%)分別提高了31.5%(P=0.008)和21.2%(P=0.013)，且比FS的凋亡率分別提高了42.3%(P=0.006)和32.0%(P=0.009)。而空白納米粒BPTN組與陰性對照組相似，當HepG2細胞與BPTN共同孵育24、72 h后，細胞的存活率均在97%以上，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS對HepG2細胞無明顯毒性和誘導其凋亡的作用。

圖4PLGA、TPGS與PLGA-STPGS的1H-NMR圖

Fig.41H-NMR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3.2TUNEL試劑盒檢測結果 以FS為對照，用TUNEL原位凋亡試劑盒檢測2種NPs誘導HepG2細胞凋亡的結果如圖7所示。陽性對照組中所有細胞核均被TUNEL標記呈綠色熒光，同時被DAPI標記呈藍色熒光。與對照組相比，其他組細胞核均被DAPI標記呈藍色熒光，但是其中只有凋亡的細胞核被TUNEL標記呈綠色熒光，而未凋亡的細胞核在該條件下不呈現綠色熒光。與EMS組相比，EMO納米粒組中有更多的細胞核被TUNEL標記呈綠色熒光，EPTN組中細胞核被標記的最多。明場下觀察，凋亡的HepG2細胞體積變小、形狀變圓，部分核膜破裂。同樣空白納米粒BPTN組與HepG2細胞共同孵育24、72 h后，每孔中幾乎觀察不到被TUNEL標記的呈綠色熒光的細胞核，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS對HepG2細胞無明顯毒性和誘導其凋亡的作用。

圖5PLGA、TPGS和PLGA-STPGS的DSC熱吸收圖

Fig.5 DSC heating thermographs of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

圖6大黃素納米粒的透射電鏡圖

Fig.6 TEM images of EMO-loaded NPs (×200 000)

A：EPN；B：EPTN。

表1EGPN和EPN的表征

表2AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測HepG2細胞與BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡結果

組別孵育時間(h)細胞比例(%)存活細胞凋亡細胞壞死細胞陰性對照組2497.9±1.91.8±0.60.3±1.07295.1±1.82.3±0.82.6±1.2BPTN組2498.2±1.20.8±0.41.0±0.57297.1±1.31.2±0.61.7±1.1FS組2458.9±3.017.8±1.323.3±2.47245.6±2.820.1±1.734.3±1.4EMS組2465.4±2.728.1±1.46.5±1.37258.3±2.730.9±1.810.8±1.3EPN組2450.8±2.441.6±2.2ac7.6±0.97237.5±2.352.1±2.6bc10.4±1.0EPTN組2446.7±2.2a47.2±2.1ac6.1±1.77224.9±2.2b62.4±2.6bd12.7±1.0

與相應的FS組比較，aP<0.05、bP<0.01；與相應的EMS組比較，cP<0.05、dP<0.01。

3 討 論

本研究采用酯化方法直接以市售材料PLGA和TPGS為原料合成PLGA-STPGS，方法簡單、成本低，所用的催化劑DMAP和甲烷磺酸催化效率高，中間體STPGS水溶性較好，故選擇極性非常小的石油醚做沉淀劑能直接將其沉淀出來，PLGA-STPGS相對脂溶性較強，不溶于水和乙醇，而用無水乙醇做沉淀劑也能將其直接沉淀出來，所得產物產率高(83.9%)、純度好。

多項研究證實，EMO能誘導多種腫瘤細胞凋亡[11-14]，尤其是在肝癌治療中，EMO具有廣譜的抗肝癌活性，能影響肝癌細胞的多種相關基因，能明顯誘導肝癌細胞的凋亡[15]。本研究采用2種方法定量、定性地考察在誘導人肝癌細胞HepG2凋亡試驗中，自制材料制備的EPTN是否具有比EMS和EPN更好的效果。通過預試驗發(fā)現濃度大于20 μg/mL的EMO在48、72 h時引起HepG2細胞的壞死率較高，凋亡細胞較少，而EMO濃度低時，細胞存活率較高，均不利于試驗結果的觀察，故確定本研究的藥物濃度為20 μg/mL。圖7顯示，載EMO納米粒誘導的細胞凋亡率高于EMS(呈綠色熒光的細胞核更多)，這是因為納米粒能被HepG2細胞直接攝取進入細胞內，不需要生物膜的轉運過程，故能有大量的納米粒進入細胞并在溶酶體的作用下釋放出EMO，使其更好的發(fā)揮誘導HepG2凋亡的作用。同時，Annexinv-FITC/FI與TUNEL檢測結果均顯示EPTN有更高的細胞凋亡率，這是因為EPTN粒徑更小、更容易被HepG2細胞攝取、進入細胞內的EPTN更多，EPTN載藥量更大，所用材料PLGA-STPGS中TPGS具有良好的水溶性，隨著材料本身在細胞內的降解，TPGS還可加快PLGA-STPGS的溶解，使EPTN中的EMO釋放的更快、更完全，進而使更多的EMO在細胞內發(fā)揮藥效。結果表明，本研究成功地合成了新的高分子材料PLGA-STPGS，并用定量、定性等方法證明了以PLGA-STPGS為載體制備的納米粒EPTN能在體外誘導HepG2細胞產生更高的凋亡率。

圖7TUNEL試劑盒檢測HepG2細胞與陽性對照、BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡效果

Fig.7 Apoptosis of HepG2 cells induced by positive control, BPTN, FS, EMS, EPN and EPTN after 24 h and 72 h of incubation timeinvitrousing TUNEL Apoptosis Detection Kit (×400)