張 庭，史晨輝，高立華

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東佛山 528200； 2. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆石河子 832002)

結(jié)核病是一種常見的慢性感染性疾病。每年有數(shù)以百萬計(jì)的人被診斷為結(jié)核病，2015年，結(jié)核病成為全球10大導(dǎo)致死亡的疾病之一。致死率高于HIV，是目前主要導(dǎo)致死亡的感染性疾病。我國在結(jié)核病控制方面取得很大成績，但仍然是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國家。每年新發(fā)結(jié)核患者約90萬，位居全球第3位[1]。據(jù)報(bào)道，全世界有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌，2～3億(5%～15%)潛伏結(jié)核感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)在其一生中會(huì)進(jìn)展為結(jié)核病[2]。這些患者為何會(huì)進(jìn)展為結(jié)核病，目前尚未完全研究清楚。

結(jié)核病發(fā)病一般認(rèn)為與環(huán)境、基因相關(guān)。既往研究通過雙胞胎、候選基因關(guān)聯(lián)研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study, GWAS)發(fā)現(xiàn)結(jié)核病與患者基因相關(guān)聯(lián)[3-5]。隨著近年來多耐藥結(jié)核和HIV患病率的上升，脊柱結(jié)核的發(fā)生率在持續(xù)升高[6]。脊柱結(jié)核常常累及椎體和椎間盤，并且會(huì)導(dǎo)致脊柱不穩(wěn)定、脊柱后突畸形、壓縮性骨折和神經(jīng)損傷。寡腺苷酸合成酶1(OAS1)作為OAS家族中的一員，被雙鏈RNA激活并且促進(jìn)寡聚化ATP酶轉(zhuǎn)化成2′-5′寡聚腺苷酸(2-5A)。OAS屬于干擾素(interferon, IFN)誘導(dǎo)酶，由IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生[7]，而IFN在人體清除結(jié)核分枝桿菌的過程中發(fā)揮重要作用[8]。OAS1基因位于12號染色體，在人體固有免疫對抗病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，OAS1基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)[9-10]。目前尚無研究報(bào)道OAS1基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核發(fā)病的關(guān)系。本研究將探討OAS1基因rs1131454和rs10774671位點(diǎn)多態(tài)性與脊柱結(jié)核的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象實(shí)驗(yàn)組脊柱結(jié)核患者113名來自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，114名健康對照組來自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心。實(shí)驗(yàn)組和對照組參與者均無血緣關(guān)系。脊柱結(jié)核通過影像學(xué)檢查、血清學(xué)檢查、術(shù)后病灶組織病理切片、膿液抗酸染色及分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌確診。實(shí)驗(yàn)組和對照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤、HIV陽性、免疫疾病、肝病和其他慢性疾病。所有納入對象均簽署知情同意書，同時(shí)記錄基本信息。

1.2DNA提取和基因分型每位參與者抽取5 mL靜脈血，儲(chǔ)存在EDTA抗凝管中并存放在-20 ℃冰箱中。用DNA提取試劑盒(Axygen Scientific公司生產(chǎn))從全血中提取DNA，然后存放在-20 ℃冰箱中直到基因分型。本研究基因分型方法采用多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)(iMLDR)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。測序由上海天昊遺傳分析中心完成。

1.3tagSNP的選擇方法tagSNP是一種代表性的SNP，位于高度連鎖不平衡的基因組區(qū)域，能夠代表周圍高度連鎖的多個(gè)SNP。研究tagSNP與表型的關(guān)系能夠提高研究效率，不需要將所有的基因組序列進(jìn)行分型。所有IFNG和IFNGR1基因SNP位點(diǎn)都從HapMap網(wǎng)站下載(http://www.hapmap.org/)，選取的數(shù)據(jù)是北京漢族人群。在下載tagSNP時(shí)選擇條件設(shè)置為上游延伸2 000堿基對，下游延伸2 000堿基對。所有納入的SNP篩選標(biāo)準(zhǔn)：①符合哈溫平衡定律(Hardy Weinberg Equilibrium, HWE)；②連鎖不平衡值r2≤0.8；③最小等位基因頻率≥0.05。tagSNP的篩選過程全部由在線軟件(http://gvs.gs.washington.edu/GVS144/)完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析皆用SPSS 19.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統(tǒng)計(jì)軟件。采用卡方檢驗(yàn)分析HWE和兩組性別、抽煙情況是否均衡可比；非配對t檢驗(yàn)分析兩組年齡是否有差異；使用Logistic回歸計(jì)算優(yōu)勢比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)；計(jì)量資料以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差) 表示；連鎖不平衡和單倍體分析采用在線軟件進(jìn)行分析(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)。連鎖不平衡分析采用r2進(jìn)行評估(r2<0.5)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1研究對象的基本信息年齡、性別、吸煙情況在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1實(shí)驗(yàn)組和對照組基本信息

Tab.1 The basic characteristics of the experimental group and control group

特征實(shí)驗(yàn)組(n=113)對照組(n=114)P年齡(歲, x±s)39.35±17.1237.84±17.110.509男性[n(%)]66(58.4)68(59.6)0.893抽煙[n(%)]33(29.2)41(36.0)0.322

2.2基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核的相關(guān)性所有納入基因位點(diǎn)符合HWE，表2為兩組基因型和基因頻率分布。兩組中等位基因模型沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2OAS1基因在實(shí)驗(yàn)組和對照組中的基因型分布

Tab.2 Association between OAS1 genotypic/allelic frequencies and spinal tuberculosis

SNP基因型實(shí)驗(yàn)組頻數(shù)(%)對照組頻數(shù)(%)POR95% CIrs1131454AA90(80)75(67)參照AG22(20)33(29)0.0030.5320.354～0.801GG 0(0) 4(4)0.0080.7880.660～0.940A202(52)183(48)參照G22(35)41(65)0.1401.0070.998～1.017rs10774671AA78(69)84(74)參照AG32(28)27(24)0.4441.2690.690～2.332GG 3(3) 3(3)0.9510.9480.177～5.068A188(49)195(51)參照G38(54)33(46)0.5361.1770.703～1.970

在rs1131454基因位點(diǎn)中，與AA基因型比，AG為脊柱結(jié)核保護(hù)因素(OR=0.532，95%CI：0.354～0.801，P=0.003)。同時(shí)，GG與AA相比較也是脊柱結(jié)核保護(hù)因素(OR=0.788，95%CI：0.660～0.940，P=0.008)。

2.3單倍體分析和連鎖不平衡分析本研究中rs1131454和rs10774671無連鎖關(guān)系(r2<0.5，圖1)。單倍體分析結(jié)果提示，GC單倍體是脊柱結(jié)核的保護(hù)因素(OR=0.49，95%CI：0.28～0.86，P=0.010)。

表3實(shí)驗(yàn)組和對照組的單倍體分析

Tab.3 Haplotypes of the OAS1 genes and their distributions in the patients and controls

單倍體實(shí)驗(yàn)組頻數(shù)(%)對照組頻數(shù)(%)POR(95% CI)AC31(14)27(12)0.5491.18(0.68～2.06)AG169(76)156(70)0.1241.39(0.91～2.12)GC22(10)41(18)0.0100.49(0.28～0.86)

圖12個(gè)SNP的連鎖不平衡分析

Fig.1 Linkage disequilibrium r2values for the two SNPs

3 討 論

本研究首次探討了OAS1基因rs1131454和rs10774671位點(diǎn)多態(tài)性與脊柱結(jié)核的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了rs1131454 AG、GG基因型是脊柱結(jié)核的保護(hù)因素。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GC單倍體與脊柱結(jié)核相關(guān)，也是它的保護(hù)因素。結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響，包括病原體、宿主自身免疫狀況、環(huán)境等因素，基因多態(tài)性在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。研究結(jié)果證明，OAS1基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核的發(fā)病是相關(guān)的。

在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中，IFN α/β起重要作用[12]。當(dāng)機(jī)體在抵抗外來病原體時(shí)，IFN-α、IFN-β和IFN-γ在機(jī)體免疫反應(yīng)中作用重大，其中IFN-γ在控制細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌感染起重要作用，它通過激活吞噬細(xì)胞、單核細(xì)胞核Th1細(xì)胞更好的清除結(jié)核菌[13]。而IFN能夠誘導(dǎo)OAS酶的合成，OAS酶在固有免疫和抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。OAS1作為OAS家族中的一員，可通過IFN結(jié)合到特應(yīng)性抗體引起OAS1酶的激活[14]，促進(jìn)2-5A的合成，和潛在RNA酶L結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成激活狀態(tài)。這種激活狀態(tài)在細(xì)胞凋亡、分化和蛋白合成中起重要作用。我們研究假設(shè)的提出是基于OAS1與IFN-γ緊密聯(lián)系從而影響結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，OAS1基因多態(tài)性通過影響基因表達(dá)、酶活性等影響OAS1蛋白的功能。國內(nèi)外基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究證明了OAS1基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展是相關(guān)的。目前關(guān)于OAS1研究最多的是其與病毒之間的關(guān)聯(lián)性研究，比如西尼羅病毒、肝炎病毒、屈曲病毒、麻疹病毒等等，這些病毒侵入機(jī)體引起機(jī)體發(fā)病都被證明與OAS1的基因多態(tài)性有關(guān)。同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)道，1型糖尿病、自身免疫性疾病也與OAS1基因多態(tài)性相關(guān)。目前尚無研究證實(shí)OAS1基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，OAS1基因多態(tài)性與脊柱結(jié)核發(fā)病的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。首先，OAS蛋白的主要作用是參與固有免疫，已有報(bào)道證實(shí)OAS蛋白在細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道OAS1在免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在結(jié)核的感染、進(jìn)展過程中，機(jī)體免疫反應(yīng)參與結(jié)核桿菌的清除。其次，OAS1基因可能通過Ⅱ型IFN通路影響脊柱結(jié)核的發(fā)生發(fā)展，IFN-γ在機(jī)體抵抗細(xì)菌入侵時(shí)發(fā)揮重要作用，可以通過激活巨噬細(xì)胞進(jìn)而抑制結(jié)核桿菌的生長、繁殖。NOGUCHI等[15]證明OAS1基因多態(tài)性與呼吸道感染是相關(guān)聯(lián)。

rs1131454作為一個(gè)功能性位點(diǎn)，位于進(jìn)化保守3號外顯子區(qū)域，其特點(diǎn)是非同義替換(G→A等位基因的突變導(dǎo)致G→S氨基酸的改變)。rs1131454位點(diǎn)位于OAS1異構(gòu)體的dsRNA結(jié)合部位附近，3種基因型AA、AG和GG可分別導(dǎo)致OAS1酶出現(xiàn)低、中度、高度3種活性[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)了雜合子模型和純合子模型與脊柱結(jié)核相關(guān)聯(lián)，AG和GG基因型與脊柱結(jié)核相關(guān)聯(lián)，這一點(diǎn)與上述酶活性相一致。rs1131454在以前的報(bào)道中被證實(shí)與1型糖尿病和嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)聯(lián)[17-18]。rs10774671位于OAS1基因7號外顯子剪接受體，并且rs10774671能夠影響OAS1基因剪接作用[9]。rs10774671是OAS1的功能性位點(diǎn)，也可以影響OAS酶抗病毒活性。既往研究發(fā)現(xiàn)，rs10774671多態(tài)性與病毒、1型糖尿病、呼吸道感染相關(guān)[9,17,19]，本研究首次發(fā)現(xiàn)rs10774671多態(tài)性與脊柱結(jié)核無關(guān)聯(lián)。

綜上所述，OAS1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1131454與脊柱結(jié)核的發(fā)生具有一定相關(guān)性，尤其是攜帶G等位基因的患者更可能發(fā)展成為脊柱結(jié)核。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們有必要擴(kuò)大樣本量、在其他民族中驗(yàn)證，并做一些功能性研究進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。