王一清，郭東賢，趙益童，郭源旭，孫夢瑤， 黃 璜，袁 瑩，韓 燕，孫 健,3,

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061； 2. 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西西安 710004；3. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，陜西西安 710061)

硒是哺乳動物必需的微量元素之一，在機體中以硒蛋白的形式發(fā)揮作用。硒蛋白是含有硒代半胱氨酸(Sec)的蛋白質(zhì)，也是體內(nèi)硒代謝的主要形式。Sec是由密碼子UGA介導(dǎo)的翻譯插入，DNA中對應(yīng)序列為TGA。Sec參與硒蛋白活性中心的構(gòu)成。人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的25種硒蛋白包括谷胱甘肽過氧化物酶家族(GPXs)、硫氧還蛋白還原酶家族(TRXRs)、脫碘酶家族(DIO)及硒蛋白H、I、K、M、N、O、P、S、T、V、W、X，SEP15[1]。

硒與骨軟骨發(fā)育密切相關(guān)[2-4]。但硒蛋白與骨軟骨相關(guān)的研究集中在與骨疾病發(fā)生相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性分析、抗氧化功能，以及血硒濃度、硒蛋白濃度及活性的測定等方面。包括Dio2、SelS基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]；IL-1β使培養(yǎng)牛軟骨細胞H2O2在線粒體堆積，導(dǎo)致線粒體損傷，間接使GPx活性升高[7]；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者滑膜細胞作為氧化應(yīng)激的發(fā)生器極高表達TrxR1[8]；脛軟骨發(fā)育障礙(tibial dyschondroplasia, TD)的雞生長板Dio2低表達[9]。硒蛋白在軟骨細胞的表達能夠調(diào)節(jié)骨的重吸收和骨重建，影響細胞內(nèi)外的氧化信號、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)翻譯后修飾，清除活性氧中間產(chǎn)物(ROIs)。然而，硒蛋白在骨軟骨中的生物學(xué)意義和對疾病治療的潛在功能還知之甚少[10]，甚至沒有硒蛋白在關(guān)節(jié)軟骨表達譜的報道。本文取軟骨生成不同階段大鼠股骨軟骨，研究硒蛋白在關(guān)節(jié)軟骨表達的時間特異。

1 材料與方法

1.1實驗動物分別取0 d(d0)、7 d(d7)、14 d(d14)、21 d(d21)、28 d(d28)、35 d(d35)、42 d(d42)齡近交系DA大鼠各10只(雌雄各5只，瑞典隆德大學(xué)引進)，動物在SPF級動物房繁育，環(huán)境維持室溫(25±3)℃，相對濕度40%～60%，每日人工照明12 h。動物墊料經(jīng)高壓蒸汽滅菌，動物飲滅菌涼開水，喂無菌顆粒飼料。

1.2主要試劑DEPC購于深圳晶美公司，Trizol試劑購于Invirtogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM)購于加拿大Fermentas Life Sciences, International公司，12種硒蛋白(GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、TrxR1、TrxR2、TrxR3、Sel S、Dio1、Dio2、Sel P、Sel W)引物和內(nèi)參GAPDH引物由奧科生物公司合成。GPx1(IHC)抗體購于EPITOMICS公司。

1.3方法

1.3.1動物處理 大鼠麻醉處死后，打開股骨關(guān)節(jié)，小心剝離出右后肢股骨頭軟骨，立即放入液氮后儲存于-80 ℃；小心截取左后肢股骨，浸入40 g/L多聚甲醛中固定。

1.3.2組織學(xué)HE染色檢測軟骨增殖、分化情況 左后肢股骨浸入100 mL/L甲醛溶液中固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度6 μm，HE染色后觀測骨軟骨發(fā)育不同階段關(guān)節(jié)軟骨增殖與分化基本情況。

1.3.3RT-PCR和RT-qPCR檢測12種硒蛋白在大鼠股骨表達情況 剝離出右后肢股骨頭軟骨Trizol?法提取總RNA，試劑盒法反轉(zhuǎn)錄得cDNA，儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。由NCBI網(wǎng)站獲取大鼠12種硒蛋白及GAPDH(內(nèi)參)mRNA序列全長，利用Primer5軟件設(shè)計跨外顯子引物。引物及PCR條件見表1。將20 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取d0、d21、d42大鼠關(guān)節(jié)軟骨cDNA，對Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio2、SelS 5種硒蛋白表達進行RT-qPCR定量。

1.3.4免疫組化檢測大鼠股骨Gpx1表達情況 取d42大鼠左后肢股骨組織切片，常規(guī)脫蠟至水，Gpx1抗體4 ℃孵育16 h，加二抗，DAB顯色。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，所有統(tǒng)計分析用Statview軟件完成。相關(guān)分析采用Pearson檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠骨軟骨發(fā)育不同階段股骨頭HE染色光鏡下HE染色顯示，各時間點所取大鼠股骨頭，d0可見全部為關(guān)節(jié)軟骨細胞(圖1A)；d7可見軟骨細胞增殖，第1次骨化中心出現(xiàn)(圖1B)；d14可見軟骨細胞增殖，第1次骨化中心形成并且開始成骨，2次骨化中心出現(xiàn)(圖1C)；d21可見軟骨細胞增殖，1次骨化中心繼續(xù)成骨，2次骨化中心形成(圖1D)；d28(圖1E)軟骨細胞繼續(xù)增殖；d35可見軟骨細胞繼續(xù)分化，1次骨化中心成骨，2次骨化中心形成骺板使長骨生長(圖1F)；d42可見軟骨細胞進一步分化，骨形成，骺板繼續(xù)使長骨生長(圖1G)。

2.212種硒蛋白在股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達變化PCR產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)，Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2、SelS 6種硒蛋白在骨軟骨發(fā)育不同階段呈現(xiàn)不同程度的差異表達(圖2A)。RT-qPCR定量結(jié)果可知，在d0、d21、d42大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中Gpx1表達在d21(P=0.004 3)和d42(P=0.005 1)顯著升高，Dio2表達在d21(P=0.013 5)和d42(P=0.014 8)也顯著升高；同時Gpx2和Gpx4穩(wěn)定表達(圖2B)。

2.3GPX1在股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達情況d42大鼠股骨的免疫組化檢測結(jié)果(圖3)顯示，GPX1特異性的在骺板部位呈高表達，而在股骨的其他部位表達非常低。

表1大鼠12種硒蛋白基因Real-timePCR引物序列及反應(yīng)條件

Tab.1 Primer sequences and reaction conditions of 12 selenoproteins in rats for Real-time PCR

基因名稱序列(5'-3')退火溫度循環(huán)數(shù)產(chǎn)物大小(bp)Gpx1上游:5'-GGCTCACCCGCTCTTTACCTTC-3'下游:5'-CGCACTGGAACACCGTCTGG-3'60℃30168Gpx2上游:5'-GCCGTGCTGATTGAGAATGTGG-3'下游:5'-TCCTGATGTCCGAACTGGTTGC-3'60℃30137Gpx3上游:5'-ACTCCTGCCCTCCCACTGC-3'下游:5'-GCTGCCTGCCGCCTCATATAG-3'60℃30199Gpx4上游:5'-AATTCGCAGCCAAGGACATCG-3'下游:5'-CCAGGATTCGTAAACCACACTCG-3'60℃30168TrxR1上游:5'-AAAGTTTACTCAGCAGAGCGGTTC-3'下游:5'-GCACATTCCAAGGCGACATAGG-3'60℃30170TrxR2上游:5'-TTCAGCCAAGCACATAGTCATCG-3'下游:5'-GCCAATACCAGTGAGGAAGCC-3'60℃30187TrxR3上游:5'-CTCTGTCCTTCTTCGTGGCTTTG-3'下游:5'-TGTATGTCCCTTCTACTGTCTCTGG-3'60℃30191Dio1上游:5'-TGACCAGTTCAAGAGACTCGTAGAC-3'下游:5'-TTCGGTGCTGCCTGATGTCC-3'60℃30128Dio2上游:5'-TCTCCTCGGTGGCTGACTTCC-3'下游:5'-GCACATCGGTCCTCTTGGTTCC-3'60℃30130SelP上游:5'-CGCTTACTGTGAGAAGAGGTGTG-3'下游:5'-ATGGTGCTTGTGGTGGTTATGC-3'60℃30136SelS上游:5'-TTCCTGCACGTCACAGTGGG-3'下游:5'-TTAAAGCCCTCAGTCGCAGG-3'60℃30115SelW上游:5'-CGGGTTCTTTGAAGTGACGGTAG-3'下游:5'-GGCGGCTTTGATGGCAGTC-3'60℃30115Gapdh上游:5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'下游:5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'65℃28148

圖1SD大鼠左后肢股骨頭骨軟骨發(fā)育7個時間點關(guān)節(jié)軟骨的HE染色

Fig.1 Left femoral head morphology of different developmental stages (×200)

A～G：產(chǎn)后0、7、14、21、28、35、42 d。

圖2SD大鼠發(fā)育過程中不同時間點軟骨硒蛋白表達情況

Fig.2 Expressions of selenoproteins in the femoral head cartilage of SD rats

A：股骨頭軟骨細胞12種硒蛋白表達PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。6種硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2、SelS呈現(xiàn)不同程度的差異表達；B：d0、d21、d42大鼠股骨頭軟骨細胞4種硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio2表達結(jié)果(RT-qPCR)Gpx2和Gpx4穩(wěn)定表達，Gpx1和Dio2表達隨著大鼠軟骨發(fā)育顯著升高。*P<0. 05，**P<0.01。

圖3d42DA大鼠股骨GPX1表達情況(免疫組化)

Fig.3 GPX1 expression of the femoral head cartilage with immunohistochemistry assay at D42 in DA rats

3 討 論

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease, KBD)是一種由于骨軟骨發(fā)育異常所導(dǎo)致的慢性、地方性、變形性骨關(guān)節(jié)病，以四肢關(guān)節(jié)軟骨和骺板軟骨的近骨性、多發(fā)性、灶性帶狀壞死為主，病因尚未明了，低硒環(huán)境因子和生物致病因子聯(lián)合作用是大骨節(jié)病主要病因假說之一[3,11]。硒對大骨節(jié)病發(fā)病過程的保護作用還有待進一步研究[3,11]。Sec-tRNA基因敲除小鼠表現(xiàn)出類似KBD的骨骼發(fā)育異常[12]，而硒蛋白作為機體內(nèi)硒的最主要代謝形式，說明硒缺乏導(dǎo)致的硒蛋白合成障礙在KBD發(fā)病的作用是不容忽視的。

真核生物硒蛋白合成的調(diào)控，是通過位于mRNA 3′-UTR區(qū)的一個特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)——硒代半胱氨酸插入元件(selenocysteine insertion sequence, SECIS)作為順式作用元件，同時有Sec-tRNA、特異翻譯因子SelB、絲氨酰-tRNA合成酶、硒代半胱氨酸合成酶(SelA)、硒代磷酸合成酶(SelD)等多種反式作用因子的協(xié)同作用進行的[12-16]。另外，TrxR基因在SBP2作用下能夠進行選擇性剪接，導(dǎo)致特定條件下產(chǎn)生有活性(長片段)與無活性(短片段)兩種不同的表達產(chǎn)物[17]，缺硒時，合成的TRXR1 C端缺少-Gly-Cys-COOH 2個氨基酸殘基，導(dǎo)致細胞迅速的死亡[18]。

SAVASKAN等[19]發(fā)現(xiàn)，在小鼠大腦內(nèi)，Gpx4呈時空特異性表達：胚胎神經(jīng)元細胞高表達、出生后低表達、成年小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞不表達，同時Gpx4敲除小鼠因大腦不能發(fā)育導(dǎo)致死胎。UFER等[20]證實GPx4的這種作用，受到其合成過程中富鳥嘌呤序列結(jié)合因子1(guanine-rich sequence-binding factor 1,Grsf1)的調(diào)控，Grsf1作用于Gpx4轉(zhuǎn)錄后加工，上調(diào)Gpx4表達，促進小鼠大腦發(fā)育；當(dāng)siRNA敲除Grsf1后，小鼠出現(xiàn)大腦發(fā)育遲緩等類似Gpx4低表達的癥狀，而Gpx4過表達則癥狀緩解。

本研究發(fā)現(xiàn)，在骨軟骨發(fā)育過程中，硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2呈現(xiàn)不同程度的差異表達，尤其是Gpx1在青春期及性成熟大鼠長骨的骺板特異的高表達。本課題組將進一步研究找出調(diào)控硒蛋白在骺板特異表達的分子機制及信號通路，進而了解硒蛋白在骨骼發(fā)育中的真實作用及這種作用對骨軟骨發(fā)育調(diào)控的機制。在骨骼發(fā)育過程中，當(dāng)由于低硒或其他因素導(dǎo)致某種硒蛋白合成障礙時，是否會有類似TrxR1截短體導(dǎo)致細胞迅速死亡[17]，或者Gpx4合成障礙導(dǎo)致大腦發(fā)育異常的情況，引起骺板深層軟骨細胞壞死，進而引起大骨節(jié)病的發(fā)生?如果這種關(guān)鍵硒蛋白的表達調(diào)控軟骨內(nèi)化骨的作用機制成立，那么低硒誘發(fā)骨發(fā)育疾病的流行病學(xué)特征就容易理解了，即硒不是影響骨軟骨發(fā)育的直接因素[3]，但硒缺乏可能會導(dǎo)致硒蛋白生物合成的障礙[15]。這提示骨軟骨發(fā)育可能與關(guān)鍵硒蛋白的生物合成有關(guān)，而這種合成受到了多種因素和多種層次的調(diào)控。因而，以硒蛋白表達的時空特異性入手，獲得骨軟骨發(fā)育不同階段硒蛋白表達譜，進而找到關(guān)鍵硒蛋白，了解關(guān)鍵硒蛋白表達調(diào)控的機制就成為了重要環(huán)節(jié)，這也正是本研究的目的所在。我們期望本研究對骨軟骨發(fā)育的調(diào)控機制研究、骨軟骨發(fā)育異常導(dǎo)致的大骨節(jié)病病因研究及關(guān)節(jié)軟骨細胞異常凋亡導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎的病因研究開辟新的途徑，進一步找到相關(guān)的診斷標記分子和未來藥物的靶分子。