鄧海靜，王 瑾，侯曉麗，高學(xué)敏，楊 方

(1. 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 河北省慢性疾病重點實驗室； 3. 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北唐山 063000)

一次性支氣管灌注二氧化硅(SiO2)粉塵致大鼠硅肺纖維化后，硅結(jié)節(jié)內(nèi)會出現(xiàn)很多具有更強(qiáng)收縮、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力的肌成纖維細(xì)胞，這些肌成纖維細(xì)胞是硅肺發(fā)生時的主要效應(yīng)細(xì)胞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，這些α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達(dá)陽性的肌成纖維細(xì)胞可以來自于肺內(nèi)固有的成纖維細(xì)胞[1]，而有文獻(xiàn)報道支氣管和肺泡的上皮細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的另一重要的細(xì)胞來源[2]，并且課題組體外實驗研究也發(fā)現(xiàn)A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株在TGF-β1誘導(dǎo)下能成功向間質(zhì)細(xì)胞(肌成纖維細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化[3]。而在硅塵所致的硅肺纖維化中是否存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本實驗擬采用大鼠體內(nèi)一次性支氣管灌注SiO2粉塵，觀察矽塵所致的硅肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中硅結(jié)節(jié)的形成及硅結(jié)節(jié)中是否存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，以闡明(硅)肺纖維化發(fā)生的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑SPF級雄性成年Wistar大鼠(動物許可證SCXK京20090003，北京維通利華動物公司)；α石英粉塵(中國疾病預(yù)防控制中心)；藥物微量釋放泵(Alzet 2 mL，美國DURECT Corporation)；鼠α-SMA多克隆抗體(1184-1，EPITOMICs)；兔vimentin多克隆抗體(2707-1，EPITOMICs)；兔E-cad多克隆抗體(ZS-7870，北京博奧森)；兔SP-A多克隆抗體(EL925092, Eterlife, UK)；兔多克隆抗體Ⅰ型膠原(BA0325, Gene Tex)；兔多克隆抗體GAPDH、鼠單克隆抗體β-actin(SC-25778, SC-17778, Santa Cruz)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(SP-9001，北京中杉金橋)；BCIP/NBT顯色試劑盒(E-116, Amresco)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9032，北京中杉金橋)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組40只大鼠隨機(jī)分為4組：①模型對照組(分為4周組和8周組)：每只大鼠支氣管內(nèi)灌注生理氯化鈉1.0 mL，腹腔內(nèi)埋入注入生理氯化鈉的微量藥物釋放泵，分別于4周、8周處死；②硅肺模型組(分為4周組和8周組)：每只大鼠支氣管內(nèi)灌注SiO2(50 mg/mL)混懸液1.0 mL，腹腔內(nèi)埋入注入生理氯化鈉的微量藥物釋放泵，分別于4周、8周處死。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色檢測α-SMA和vimentin的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原高壓熱修復(fù)。30 mL/L過氧化氫室溫孵育10 min。PBS沖洗，后滴加100 mL/L正常山羊血清封閉后，甩掉多余液體，按SP免疫組織化學(xué)實驗步驟，滴加一抗vimentin(EPITOMIC，1∶200)、α-SMA(EPITOMIC，1∶200)4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，梯度乙醇逐步脫水，二甲苯進(jìn)行透明，最后用中性樹膠封片。將染色后切片用OLYMPUS顯微鏡(BX53，JAPAN)進(jìn)行圖像采集。

1.3.2激光共聚焦檢測SP-A和α-SMA的共定位表達(dá) 冰凍切片用PBS沖洗，抗原高壓熱修復(fù)，100 mL/L BSA封閉30 min，甩干，不洗，直接滴加兩種一抗的混合物(SP-A和α-SMA，1∶200稀釋)，4 ℃冰箱過夜，滴加二抗(1∶50稀釋)，避光37 ℃孵箱孵育2 h，滴加Hoechst 33258置于切片組織上，37 ℃孵箱孵育10 min。用抗熒光衰減封片劑封片。

1.3.3Western blot檢測上皮標(biāo)志蛋白和間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達(dá) 取大鼠右肺上葉肺組織，按80 mg加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的RIPA裂解液(含2%蛋白酶抑制劑，現(xiàn)用現(xiàn)配)，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度后并配平，以每個泳道80 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。將膜放入配好的抗體中(E-cad、SP-A、vimentin、α-SMA、Ⅰ型膠原1∶200稀釋；GAPDH、β-actin 1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(1∶500稀釋)37 ℃孵育2 h，BCIP/NBT顯色劑顯色數(shù)分鐘，見有清晰條帶出現(xiàn)，即用純水終止顯色。用Image J軟件對蛋白條帶測量吸光度值，經(jīng)與相應(yīng)的內(nèi)參平衡后，與空白對照組的某一樣本做比值，以其比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。4周、8周對照組和硅肺模型組采用多因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1間質(zhì)標(biāo)記蛋白α-SMA、vimentin在硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組(4周組、8周組)雙肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄。硅肺模型組大鼠肺組織內(nèi)肺泡間隔增寬，有明顯結(jié)節(jié)形成。其中硅肺模型8周組較4周組，肺組織內(nèi)結(jié)節(jié)體積增大，并出現(xiàn)結(jié)節(jié)的融合。對照組α-SMA、vimentin只表達(dá)于血管和氣管平滑肌，而在硅肺模型組硅結(jié)節(jié)與間質(zhì)纖維化區(qū)域內(nèi)有較多α-SMA、vimentin陽性表達(dá)細(xì)胞(圖1C)。Western blot結(jié)果同時顯示，與對照組比較，硅肺模型組的α-SMA、vimentin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，分別為對照4周組的1.6倍和3.7倍；為對照8周組的1.6倍和2.9倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(α-SMA，F(xiàn)=5.431，P=0.038 1；vimentin，F(xiàn)=55.79，P<0.000 1，圖1B)。

圖1間質(zhì)標(biāo)記蛋白(α-SMA和vimentin)在大鼠硅肺模型中的表達(dá)

Fig.1 The expressions of mesenchymal cell markers (α-SMA and vimentin) in the rat silicosis model (Immunocytochemical analysis, ×400, Western blot)

C4：對照4周組；Si4：硅肺模型4周組；C8：對照8周組；Si8：硅肺模型8周組。與對照組相比，*P<0.05。

2.2間質(zhì)標(biāo)記蛋白SP-A、E-cad在硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，硅肺模型組的SP-A、E-cad 蛋白表達(dá)明顯減弱，其中硅肺模型4周組SP-A、E-cad蛋白的表達(dá)均為對照組的50%；硅肺模型8周組SP-A、E-cad蛋白的表達(dá)為對照組的21%和35%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(SP-A，F(xiàn)=150.9，P<0.000 1；E-cad，F(xiàn)=54.36，P<0.000 1，圖2)。

圖2上皮標(biāo)記蛋白(SP-A和E-cad)在大鼠硅肺模型中的表達(dá)

Fig.2 The expressions of epitherial cell markers (SP-A and E-cad) in the rat silicosis model (Immunocytochemical analysis ×400, Western blot)

C4：對照4周組；Si4：硅肺模型4周組；C8：對照8周組；Si8：硅肺模型8周組。與對照組相比，*P<0.05。

2.3Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，硅肺模型4、8周組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯高于對照4、8周組(圖3)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ⅰ型膠原，F(xiàn)=15.74，P=0.003 0；Ⅲ型膠原，F(xiàn)=48.13，P=0.000 1)。

2.4α-SMA和SP-A在硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)中的共定位表達(dá)激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示(圖4)，正常對照組可見肺泡壁上有紅色熒光標(biāo)記的SP-A表達(dá)陽性細(xì)胞，體積較大，呈扁平或立方狀，在細(xì)胞中央可見藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核。細(xì)胞多貼覆在肺泡壁的腔面(圖4箭頭所指)。肺泡壁內(nèi)可見少量綠色熒光標(biāo)記的α-SMA表達(dá)陽性的細(xì)胞或區(qū)域。在硅肺模型組，可見硅結(jié)節(jié)內(nèi)有大量綠色熒光標(biāo)記的α-SMA表達(dá)陽性的細(xì)胞，其間夾雜有一定數(shù)量的紅色熒光標(biāo)記的SP-A表達(dá)陽性細(xì)胞。采用兩種蛋白熒光組合定位技術(shù)，可見一些紫粉色標(biāo)記的細(xì)胞存在于硅結(jié)節(jié)內(nèi)，多分布在結(jié)節(jié)的邊緣區(qū)域，少量分布于結(jié)節(jié)內(nèi)部(圖4箭頭所指)。這表明在硅結(jié)節(jié)中有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的存在與增生，而部分肺泡Ⅱ型上皮胞質(zhì)中有α-SMA陽性蛋白的表達(dá)。

圖3Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠硅肺模型中的表達(dá)

Fig.3 The expressions of collagenⅠ and collagen Ⅲ in rat silicosis model (Western blot)

C4：對照4周組；Si4：硅肺模型4周組；C8：對照8周組；Si8：硅肺模型8周組。與對照組相比，*P<0.05。

圖4α-SMA和SP-A在大鼠硅肺模型中的共定位表達(dá)

Fig.4 Colocalization of α-SMA and SP-A in the rat silicosis model (confocal laser scanning microscopy assay, ×600)

C8：對照8周組；Si8：硅肺模型8周組。

3 討 論

硅(塵)肺是肺內(nèi)長期吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵所引起的以肺組織彌漫性纖維化為主要表現(xiàn)的疾病。其主要的病理學(xué)變化為肺間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過多沉積導(dǎo)致肺的纖維化。近年來越來越多的文獻(xiàn)報道，上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化是肺纖維化形成過程中，細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原)合成、分泌與沉積的另一個重要的來源[5]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程在肝、腎、心臟、肺等器官纖維化形成中的作用已經(jīng)越來越引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注[6-9]。

肺臟的支氣管和肺泡表面覆蓋著一層完整的上皮組織，可以分為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞無分裂增殖的能力；Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞有分裂增殖并轉(zhuǎn)化為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞的潛能，并能修復(fù)受損傷的上皮組織。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞能分泌一種特異性的蛋白，即SP-A，具有降低肺泡表面張力、維持肺泡容量相對穩(wěn)定及阻止肺泡毛細(xì)血管內(nèi)液體向肺泡腔內(nèi)滲出等重要的生理功能，在正常的通換氣功能方面發(fā)揮著重要的作用。在愽來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中，在給予愽來霉素3～7 d，SP-A的mRNA的表達(dá)與對照組相比明顯降低[10]，在特發(fā)性肺纖維化患者血液中SP-A的含量與患者的預(yù)后緊密相關(guān)[11]，推斷SP-A的分泌含量及其表達(dá)與肺纖維化的形成和預(yù)后有著密切的關(guān)系。在本項研究中，用熒光標(biāo)記SP-A后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠肺組織的肺泡壁上可見SP-A標(biāo)記陽性的細(xì)胞(即肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞)，而在硅肺模型組大鼠肺組織中，纖維化的結(jié)節(jié)狀病灶內(nèi)也可見到部分SP-A標(biāo)記陽性的細(xì)胞，并大多分布在結(jié)節(jié)的周邊區(qū)域，表明硅肺結(jié)節(jié)病灶內(nèi)有Ⅱ型上皮細(xì)胞的存在或增生。并且與硅結(jié)節(jié)的形成及硅肺的發(fā)生密切相關(guān)。

較多的文獻(xiàn)顯示，在器官纖維化病變過程中，發(fā)生了上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，其共同特點包括細(xì)胞間的緊密連接蛋白的缺如(如E-cad)，細(xì)胞間的連接被拆解，細(xì)胞失去了極性。由于正常的組織結(jié)構(gòu)被破壞，原有的一些功能減退(包括合成分泌SP-A的能力下降)。細(xì)胞骨架被重塑，向間質(zhì)組織的表型轉(zhuǎn)變，并獲得間質(zhì)組織的標(biāo)記性蛋白(如vimentin和α-SMA)[12]。

在本項研究中我們觀察發(fā)現(xiàn)，在矽塵大鼠模型中，激光共聚焦掃描顯微鏡下可見，纖維化病灶內(nèi)可見SP-A表達(dá)陽性的細(xì)胞，多分布在結(jié)節(jié)的周邊區(qū)域。也可見較多的α-SMA表達(dá)陽性的細(xì)胞分布定位于纖維化病變區(qū)域。當(dāng)采用重合疊加技術(shù)，將兩種熒光標(biāo)記的蛋白在同一細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)共定位顯示時發(fā)現(xiàn)，纖維化病變區(qū)域的一些細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)既有SP-A表達(dá)陽性蛋白的定位，又有α-SMA表達(dá)陽性蛋白定位，即SP-A和α-SMA共同定位于纖維化病變區(qū)域內(nèi)的同一細(xì)胞內(nèi)。這一結(jié)果表明，病灶內(nèi)增生的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞部分正在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究證實了在硅肺大鼠動物模型中，纖維化病變區(qū)域內(nèi)的肌成纖維細(xì)胞部分是來源于上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Western blot結(jié)果也顯示，與模型對照組比較，標(biāo)記上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白E-cad和SP-A表達(dá)下調(diào)，而標(biāo)記間質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞的vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)。同時，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)升高。這些結(jié)果均提示，在硅肺發(fā)生時，存在著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，而上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原蛋白)過多合成與沉積的重要因素之一，也是促進(jìn)硅肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。