付立芳，孫 杰

(1. 臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東臨沂 276000；2. 山東醫(yī)學高等?？茖W校中醫(yī)學教研室，山東臨沂 276000)

結腸癌是一種常見的嚴重威脅全人類健康的消化道腫瘤。在我國，結腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位居癌癥的第五位和第三位，且呈逐年上升的趨勢。金屬蛋白酶解離素9(a disintegrin and metalloprotease 9, ADAM9)是一類膜錨定的金屬蛋白酶家族成員，廣泛參與了細胞的信號轉導過程。有研究發(fā)現，ADAM9通過活化表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)通路而極大地促進食管鱗癌細胞的生長和存活[1]。在結腸癌相關的研究中，ADAM9過表達不僅能促進癌細胞的侵襲，也能增加其耐藥性[2-3]，由此看來，ADAM9很可能是治療結腸癌發(fā)生發(fā)展的一個潛在靶基因。

miRNAs是一類內源性的非編碼小RNA，能通過抑制某些特定靶基因的表達進而調控癌癥的發(fā)生發(fā)展，例如，miR-126 通過靶向調控ADAM9抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲[4]。最近的一項研究發(fā)現，由miR-134前體3′臂剪切產生的miR-134-3p具有抑制卵巢癌干細胞增殖分化的功能[5]。全基因組篩選鑒定發(fā)現miR-134 通過靶向整合素β1(integrin β1)抑制肝癌細胞的遠端轉移[6]。盡管已知miR-134的表達在結直腸癌組織和細胞系中明顯下調[7]，并與腫瘤的轉移和生長相關，但其具體作用機制尚不明確。本文通過檢測miR-134-3p對結腸癌細胞存活和遷移的作用，進一步調查miR-134-3p和ADAM9之間的靶向關系，以期為結腸癌的治療提供潛在藥物靶點和相關理論支持。

1 材料與方法

1.1材料結腸癌細胞系SW480由第四軍醫(yī)大學細胞工程中心提供；結腸癌細胞系HCT116、RKO和正常結腸上皮細胞系NCM460購自上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；青/鏈霉素購自沃爾森生物有限公司；小鼠抗人ADAM9抗體購自美國RD公司；兔抗人EGFR和p-EGFR抗體購自美國Epitomics公司；人抗兔AKT和p-AKT(Ser 473)抗體購自美國Cell Signaling公司；兔抗小鼠β-actin抗體、HRP標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；CCK-8增殖檢測試劑盒和熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Sigma公司；實時定量RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物由廣州銳博生物有限公司設計并合成；蛋白質提取試劑盒和ECL發(fā)光液等購自Millipore公司；脂質體3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取出凍存的SW480、HCT116、RKO和NCM460細胞，復蘇后培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、青霉素和鏈霉素(各100 μg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在50 mL/L CO2、37 ℃、飽和濕度下經2.5 g/L胰酶傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。待細胞長勢良好時，取對數生長期的細胞用于分子生物學檢測或細胞轉染。

1.2.2實時定量RT-PCR檢測基因mRNA的表達 Trizol裂解細胞后提取細胞內總RNA，經RNA反轉錄試劑盒(Fermontas)將提取的RNA反轉錄得到cDNA，最后采用SYBR熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上擴增來檢測各基因mRNA的表達情況。反應條件為：90 ℃預變性10 min，按照95 ℃變性25 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的循環(huán)擴增40次。以GAPDH為內參。

1.2.3Western免疫印跡檢測蛋白表達 RIPA裂解液(美國Thermo公司)裂解細胞后提取細胞內總蛋白，吸取40 μg蛋白樣品測定蛋白濃度，然后用12% SDS-PAGE按分子質量大小分離蛋白質。切膠，將目的蛋白轉至PVDF膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫下封閉目的蛋白1.5 h，再用ADAM9、EGFR、p-EGFR、AKT或p-AKT抗體于4 ℃下過夜孵育。用HRP標記的山羊抗兔IgG室溫孵育目的蛋白1 h。加ECL發(fā)光液顯影后分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.4細胞轉染 對數期的細胞以1×105密度接種于6孔板，待細胞達80%以上融合后，采用脂質體3000孵育細胞48 h將50 nmol/L miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉染到SW480細胞。細胞分組為：Control、mimic NC、miR-134-3p mimic、Inhibitor NC、miR-134-3p inhibitor。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 離心收集轉染后的各組細胞，PBS清洗。按試劑盒說明于2～8 ℃避光條件下加入5 μL Annexin V-FITC，孵育15 min后，于相同條件下加入10 μL PI孵育5 min。最后，在流式細胞儀上檢測各組細胞的凋亡情況。

1.2.6CCK-8檢測細胞增殖 在miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉染細胞0、24、48、72、96 h后，每組分別加入10 μL CCK-8試劑于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱內孵育1 h。隨后測定各組細胞在450 nm處的A值，進而繪制細胞生長曲線。

1.2.7Transwell檢測細胞遷移 轉染后的細胞以2×104密度接種于Transwell小室表面，上層小室含Matrigel基質膠。細胞于37 ℃下孵育48 h，取出上層小室，將穿過膜的細胞收集于10 mL/L的多聚甲醛溶液，用2 mL/L的結晶紫溶液染色15 min。顯微鏡下進行細胞計數。

1.2.8熒光素酶報告實驗 PCR擴增ADAM9-3′UTR-WT和ADAM9-3′UTR-MUT序列，將擴增后的序列分別轉入重組質粒psicheck-2中；構建好的重組質粒分別與miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor共同轉染細胞，72 h后收集細胞，嚴格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit說明書操作實驗。最后通過發(fā)光化學儀檢測螢火蟲和海腎熒光比值。

2 結 果

2.1miR-134-3p在人結腸癌細胞系中低表達，而ADAM9高表達收集人結腸癌細胞系SW480、HCT116、RKO和正常結腸上皮細胞系NCM460細胞，實時定量PCR檢測了各細胞內miR-134-3p的表達。單因素方差分析顯示：miR-134-3p的表達在不同細胞系之間差異具有統計學意義(F=4.241，P=0.002)。與NCM460細胞相比，miR-134-3p在SW480、HCT116和RKO癌細胞中表達水平均顯著下調(P<0.05)，且在SW480細胞中下調最為明顯(圖1A，表1)。Western免疫印跡發(fā)現ADAM9、EGFR和AKT的蛋白表達在不同細胞系之間存在顯著差異，與正常NCM460細胞相比，3種蛋白在結腸癌細胞系中均明顯上調(P<0.05，圖1B、C、表2)。這些結果表明miR-134-3p和ADAM9/EGFR/AKT可能參與了結腸癌的發(fā)病機制。

圖1miR-134-3p和ADAM9/EGFR/AKT在人結腸癌細胞系中的表達

Fig.1 Expressions of miR-134-3p and ADAM9/EGFR/AKT in the colon cancer cell lines

A：miR-134-3p在人結腸癌細胞系中低表達；B～C：ADAM9/EGFR/AKT在人結腸癌細胞系中高表達。與NCM460組相比，*P<0.05。

表1miR-134-3p在各細胞系中的表達

細胞系相對表達NCM4601.00±0.04SW4800.43±0.05*HCT1160.55±0.06*RKO0.64±0.04*F4.241P0.002

與NCM460細胞相比，*P<0.05。

表2ADAM9/EGFR/AKT在各細胞系中的表達

細胞系ADAM9EGFRAKTNCM4601.00±0.181.00±0.241.00±0.35SW4803.62±0.31*3.02±0.28*2.54±0.24*HCT1162.75±0.26*2.63±0.31*2.81±0.19*RKO3.10±0.30*3.31±0.22*2.23±0.20*F5.0074.6583.571P0.0010.0060.034

與NCM460細胞相比，*P<0.05。

2.2miR-134-3p抑制結腸癌細胞的存活由于miR-134-3p和ADAM9在SW480細胞中的變化最為顯著，接下來的探究實驗在SW480細胞中進行。用miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉染SW480細胞以上調或抑制miR-134-3p的水平。各組細胞凋亡率差異具有統計學意義(F=6.123，P=0.001)。流式細胞術檢測結果顯示：對照組細胞凋亡率為(9.0±1.7)%，miR-134-3p mimic轉染后細胞凋亡率升高至(15.0±1.1)%，而miR-134-3p inhibitor轉染組細胞凋亡率為(5.9±1.2)%，與對照組相比，差異均有統計學意義(圖2A、B，表3)。另外，我們用CCK-8試劑盒檢測了各轉染組細胞不同時間點(24、48、72、96 h)的增殖情況，重復測量方差分析結果顯示：①不同時點間的細胞增殖率差異有統計學意義(F=4.261，P=0.005)；②不同組間細胞增殖能力差異有統計學意義(F=4.562，P=0.014)；③不同轉染組和觀察時間之間存在交互作用(F=3.508，P=0.009，圖2C，表4)。由此可見，miR-134-3p能抑制結腸癌細胞的存活。

圖2miR-134-3p抑制結腸癌細胞的存活

Fig.2 miR-134-3p inhibited cell survival

A：流式細胞術檢測細胞凋亡；B：miR-134-3p抑制了凋亡細胞的百分比；C：CCK-8檢測細胞增殖。與對照組相比，*P<0.05。

表3miR-134-3p表達水平對結腸癌細胞凋亡的影響

組別相對表達Control9.0±1.7Mimic NC9.8±2.0miR-134-3p mimic15.0±1.1*Inhibitor NC10.2±1.2miR-134-3p inhibitor5.9±1.2*F6.123P0.001

與對照組相比，*P<0.05。

2.3miR-134-3p抑制了SW480細胞的遷移Transwell小室遷移實驗結果顯示，miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉染了SW480細胞48 h后，miR-134-3p mimic組的穿膜細胞數最少，而miR-134-3p inhibitor組的穿膜細胞數最多，這一結果表明miR-134-3p能抑制SW480細胞的遷移(圖3)。

2.4miR-134-3p抑制了ADAM9/EGFR/AKT通路的活化為了探討miR-134-3p是否通過抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化從而進一步抑制癌細胞的存活和遷移，miR-134-3p mimic或miR-134-3p inhibitor轉染了細胞后，我們檢測了各組細胞內miR-134-3p和ADAM9的表達以及p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT水平。實時定量PCR檢測到miR-134-3p表達在miR-134-3p mimic組顯著上調，而在miR-134-3p inhibitor組顯著下調，這一結果表明miR-134-3p mimic與miR-134-3p inhibitor在SW480細胞中成功轉染(表5)。Western免疫印跡結果顯示，不同轉染組之間ADAM9、p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的水平差異具有統計學意義(F=3.756，P=0.033；F=4.578，P=0.015；F=3.269，P=0.045)。與對照組相比，miR-134-3p mimic轉染后ADAM9、p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的水平降低，而轉染miR-134-3p inhibitor之后，3種蛋白質的表達水平均顯著升高(P<0.05，圖4、表6)。因此，miR-134-3p通過抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化抑制了癌細胞的存活和遷移。

表4miR-134-3p表達水平對結腸癌細胞增殖的影響

時間(h)ControlMimic NCmiR-134-2pmimicInhibitor NCmiR-134-3pinhibitor00.48±0.110.46±0.090.45±0.120.50±0.060.49±0.08240.98±0.120.90±0.090.63±0.100.80±0.091.27±0.11481.48±0.111.30±0.100.79±0.141.15±0.101.87±0.15721.81±0.091.60±0.100.88±0.131.47±0.102.50±0.16962.15±0.112.00±0.081.02±0.171.80±0.122.83±0.17

圖3miR-134-3p抑制結腸癌細胞的遷移

Fig.3 miR-134-3p inhibited cell migration

圖4miR-134-3p抑制了ADAM9/EGFR/AKT通路的活化

Fig.4 miR-134-3p inhibited activation of ADAM9/EGFR/AKT pathway

A：實時定量PCR檢測細胞中miR-134-3p mRNA的表達；B：Western免疫印跡檢測細胞中ADAM9/EGFR/AKT通路的蛋白表達；C：ADAM9蛋白的相對表達量；D：p-EGFR/EGFR的相對表達量；E：p-AKT/AKT的相對表達量。與對照組相比，*P<0.05。

表5miR-134-3pmimic和inhibitor轉染后其表達水平的變化

組別相對表達水平Control1.00±0.19Mimic NC0.92±0.28miR-134-3p mimic4.10±0.34*Inhibitor NC1.17±0.22miR-134-3p inhibitor0.34±0.37*F7.001P0.005

與對照組相比，*P<0.05。

表6miR-134-3p表達水平對結腸癌細胞ADAM9/EGFR/AKT通路活化的影響

組別ADAM9p-EGFR/EGFRp-AKT/AKTcontrol1.00±0.191.00±0.161.00±0.19Mimic NC0.87±0.170.92±0.111.07±0.24miR-134-3p mimic0.54±0.14*0.44±0.10*0.66±0.20*Inhibitor NC0.93±0.200.96±0.130.98±0.22miR-134-3p inhibitor3.20±0.12*3.30±0.20*2.80±0.13*F3.7564.5873.269P0.0330.0150.045

與對照組相比，*P<0.05。

2.5ADAM9是miR-134-3p的靶基因TargetScan靶基因預測軟件結果顯示，ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域能與miR-134-3p的種子序列靶向結合，我們進一步合成了ADAM9 mRNA的3′UTR序列和其突變的序列(圖5A、表7)，并將其分別克隆到熒光素酶報告基因后轉染到SW480細胞。熒光素酶報告基因檢測結果顯示，轉入miR-134-3p mimic后，含野生型3′UTR序列組的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而突變后3′UTR組的熒光素酶活性與對照組相比沒有明顯差異(圖5B)。另外，細胞過表達miR-134-3p后，ADAM9 mRNA的表達水平下降(P<0.05)，而抑制miR-134-3p后，ADAM9 mRNA的表達水平上升(P<0.05，圖5C、表8)。

圖5ADAM9是miR-134-3p的靶基因

Fig.5 ADAM9 is a target gene of miR-134-3p

A：突變型和野生型ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域與miR-134-3p的靶向結合位點；B：熒光素酶報告顯示的各組細胞熒光素酶活性強度；C：ADAM9 mRNA的相對表達量。與對照組相比，*P<0.05。

表7熒光素酶報告基因檢測miR-134-3p與ADAM9基因的靶向關系

分組ControlmiR-134-3p mimicWT-UTR1.00±0.110.48±0.12*MUT-UTR1.00±0.090.87±0.08

與對照組相比，*P<0.05。

表8miR-134-3p表達水平對結腸癌細胞ADAM9mRNA水平的影響

組別相對表達水平Control1.00±0.13Mimic NC0.87±0.15miR-134-3p mimic0.54±0.11Inhibitor NC0.93±0.16miR-134-3p inhibitor3.20±0.19F5.278P0.021

與對照組相比，*P<0.05。

3 討 論

盡管結腸癌的診斷和治療技術逐漸走向成熟，但由于腫瘤的局部復發(fā)和遠端轉移，患者的5年生存率依然很低。因此，結腸癌的發(fā)生發(fā)展機制仍是近年來的研究重點。目前，已有不少研究發(fā)現ADAM9在多種惡性腫瘤組織中高表達，包括非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌等。ADAM9甚至被認為是腫瘤侵襲、轉移及不良預后的候選標志基因之一[8-10]。一項臨床研究發(fā)現，ADAM9能促進結腸癌的發(fā)病和血管生成[11]。在體外，ADAM9能通過激活EGFR增強結腸癌細胞的耐藥性[3]。本研究結果發(fā)現，ADAM9/EGFR/AKT通路在結腸癌細胞中被顯著激活，當ADAM9表達被抑制后，癌細胞的增殖和遷移能力降低，細胞凋亡增加，進一步表明ADAM9參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展。

近年來，miR-134-3p的抑癌功能和作用機制不斷被證實。在非小細胞肺癌中，miR-134也能通過靶向抑制細胞周期素D1(cyclin D1, CCND1)的表達來抑制癌細胞的存活[12]。在三陰性乳腺癌細胞中，胞外膜泡高表達的miR-134不僅抑制了癌細胞的遷移和侵襲能力，而且增強了對anti-Hsp90藥物的敏感性，這一研究結果表明，miR-134可作為治療乳腺癌的潛在生物靶標[13]。另外，miR-134被發(fā)現在人骨肉瘤組織和細胞中低表達，過表達的miR-134不僅抑制體外骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和存活，也能抑制活體小鼠腫瘤的發(fā)生[14]。在之前與結腸癌相關的研究中，miR-134低表達被證實與腫瘤的大小以及不良預后相關[7]。本研究發(fā)現miR-134-3p能抑制結腸癌細胞的增殖、存活和遷移，與這些研究結果一致，這也進一步證實miR-134-3p能抑制結腸癌的發(fā)生發(fā)展。

有文獻報道，miR-134-3p可通過靶向調控EGFR、程序性細胞死亡7(programmed cell death 7, PDCD7)等基因的表達調控細胞增殖和存活[15-16]，但是miR-134-3p是否能夠通過靶向ADAM9抑制癌細胞的存活仍不明確。我們通過生物信息學工具TargetScan對miR-134-3p和ADAM9之間的靶向結合位點進行了預測，發(fā)現ADAM9 mRNA的3′UTR區(qū)域能與miR-134-3p的種子序列靶向結合。熒光素酶報告分析結果發(fā)現，miR-134-3p引起野生型3′UTR序列組細胞的熒光素酶活性和ADAM9表達明顯降低，而對突變型3′UTR組沒有明顯影響，這些結果證實了ADAM9是miR-134-3p的靶基因，miR-134-3p正是通過靶向抑制ADAM9/EGFR/AKT通路的活化抑制了結腸癌細胞的存活和遷移。本研究不僅為結腸癌的治療提供了新的藥物靶點，同時也提示miR-134-3p具有較大的潛在研究和藥用價值。