王任翔，賈 皚

(1. 長安大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，陜西西安 710064；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061)

胃癌(gastric cancer, GC)是全球第四大最常見的癌癥。盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)療的發(fā)展，胃癌發(fā)病率逐漸下降[1-2]，但是，每年仍有100萬新發(fā)病例。胃癌的高發(fā)病區(qū)包括東亞、東歐和南美洲，胃癌的5年生存率約20%～25%[3]。胃癌的發(fā)生是一個多因素多步驟的過程，涉及到許多環(huán)境、遺傳、表觀遺傳和其他因素[4]。研究表明低社會經(jīng)濟地位、幽門螺桿菌感染、吸煙、飲酒和某些人口特征與胃癌高風險有關(guān)[5]。也有多項研究報道有關(guān)遺傳因素在胃癌分子發(fā)病機制中的作用[6-7]。

微小RNA(micro RNA, miRNA，miR)是18～23個核苷酸長度的分子，通過與其靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，可以抑制原癌基因和抑癌基因的翻譯，從而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞周期過程[8]。越來越多的研究證明miRNA參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者通常存在miR-21異常表達[9-10]。miR-21調(diào)控一些靶點而影響腫瘤發(fā)生。但是其確切作用機制仍知之甚少，目前尚無直接證據(jù)證明miR-21與胃癌發(fā)生之間存在相關(guān)性。本研究檢測胃癌患者miR-21的靶位點rs300574、rs4272、rs4728、rs11911、rs3744935、rs8708和rs7828的多態(tài)性，分析其與胃癌患病風險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月至2016年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科收治的胃癌患者300例，入選條件：原發(fā)性胃癌新發(fā)病例，所有病例均符合中國《胃癌診斷標準》[11]，未經(jīng)過手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等方法治療；精神狀況良好；研究對象之間無直接親屬關(guān)系。選擇同時期西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康人群300例為對照組，入選條件：既往無腫瘤病史、慢性疾病、嚴重代謝性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等；精神狀況良好；甲胎蛋白和癌胚抗原陰性；研究對象之間無直接親屬關(guān)系。本研究已獲得所有研究對象的知情同意，符合倫理學(xué)的規(guī)定，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器全血基因組純化試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，iPLEX Gold 試劑盒(美國Sequenom公司)；MassARRAY質(zhì)譜儀(美國Sequenom公司)，GeneAmp 9700 PCR儀(美國ABI公司)。

1.3血樣采集及DNA提取采集每位研究對象外周靜脈血5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，現(xiàn)場編號并登記姓名，所有標本采集當天送實驗室，置于-70 ℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進行DNA提取，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4基因分型在Target Scan Human數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/)中尋找miR-21相關(guān)的靶基因及其結(jié)合位點，并選擇中國人群具有較高頻率(最小等位基因頻率≥5%)位點，最終確定了rs300574、rs4272、rs4728、rs11911、rs3744935、rs8708和rs7828共7個位點。采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技術(shù)對所選擇的SNP位點進行分型。單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行設(shè)計和合成。在MassARRAY質(zhì)譜儀中進行反應(yīng)，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000軟件進行，引物信息見表1。

表1本研究所用到的引物序列

Tab.1 Primers used for this study

SNP_ID1st-PCRP2nd-PCRPUEP_SEQrs300574ACGTTGGATGGGGTCAGGGTAAACCATCATACGTTGGATGCAAAAAACAGCCACAACTTGAAAAAACAGCCACAACTTGAAAGCTArs4272ACGTTGGATGGATAAAACACCTAGATACCCACGTTGGATGCTAAGCCCCCAAATAAGCTGAAATAAGCTGCATGCATTTGTAACArs4728ACGTTGGATGCACATATGCAACCAACTAAACACGTTGGATGAGCATTTCACCGCAAACAGCCAAACAGCAAAGACTATCCCArs11911ACGTTGGATGGTTGGTTGCATATGTGTATACGTTGGATGCCCTAGGAACTTTGAAAAACCACAGTAATGAGGATTTTTTCTrs3744935ACGTTGGATGCCTCTACAGTGATACATGTCACGTTGGATGTGTGGCTGGGCCTGTCACCAGCCCTCCAGGTAGGCCCrs8708ACGTTGGATGGAGCTTACGTAGTTCTACCGACGTTGGATGTACCCCGATTACCAGAACAGAGGGTGGCAGAAGCACArs7828ACGTTGGATGGTGGTTCAGTATTATGTACGACGTTGGATGAATTGTGTGAACTTGGAAGCTTGGAAGCACACCAATCT

1.5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。比較兩組間的基本信息，對于連續(xù)性變量，采用t檢驗；對于分類變量，采用χ2檢驗。采用直接計數(shù)法統(tǒng)計各位點的等位基因及基因型頻數(shù)，采用χ2檢驗比較兩組間各位點的等位基因頻率的分布差異。應(yīng)用SNPStats在線軟件(http://bioinfo.iconcologia.

net/snpstats/start.htm)評估各SNP位點基因型與胃癌患病風險[12]。以相對優(yōu)勢比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示SNP與胃癌患病風險的關(guān)系。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Haploview 4.2軟件進行單體型與胃癌患病風險的相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1病例組及對照組的基本信息共收集300例胃癌患者和300例健康對照，其中胃癌組男228 例，女72例，平均年齡(56.18±13.44)歲，對照組男237例，女63例，平均年齡 (55.34±14.12)歲，胃癌病例與對照組之間在年齡、性別等人口學(xué)特征上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明兩組均衡可比。

2.2候選SNP基本信息miR-21的7個靶SNP位點的基本信息見表2，基因、染色體位置、最小/野生等位基因和最小等位基因頻率，7個位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律(HWEP>0.05)。采用χ2檢驗比較兩組間各位點的等位基因頻率差異，結(jié)果顯示SPRY1基因上rs300574位點的等位基因“C”和Bcl-2基因上rs3744935位點的等位基因“T”與增加胃癌的患病風險具有相關(guān)性(P<0.05)，而JAG1基因上rs8708位點的等位基因“C”與降低胃癌的患病風險具有相關(guān)性(P<0.05)。

表2miR-21靶位點的基本信息及其在病例和對照組中的最小等位基因頻率

Tab.2 Basic information about miR-21 target sites and minor allele frequency in the patients and the controls

SNPmiRNA基因 染色體位置等位基因最小等位基因頻率病例組(n=300)對照組(n=300)HWEPOR(95% CI)Prs300574miR-21SPRY14q28.1C/T0.4360.2920.4731.875(1.462～2.404)0.001rs4272miR-21CDK67q21.2G/A0.1190.1070.1051.135(0.778～1.668)0.526rs4728miR-21SPRY213q31.1C/A0.2480.2621.0000.942(0.718～1.294)0.687rs11911miR-21SPRY213q31.1C/A0.4670.4150.9051.239(0.976～1.581)0.082rs3744935miR-21Bcl-218q21.33T/C0.2320.1480.4771.735(1.277～2.358)0.001rs8708miR-21JAG120p12.2C/T0.2010.3350.5970.503(0.382～0.761)0.001rs7828miR-21JAG120p12.2C/A0.1640.1720.2120.948(0.688～1.221)0.776

2.3候選SNP在遺傳模型下與胃癌風險的相關(guān)性引入遺傳模型，評估風險等位基因在4個不同遺傳模型(共顯性、顯性、隱性和加性)下的風險，按照性別、年齡修正，結(jié)果見表3。在最佳模型-顯性模型下，rs300574位點的T/C和C/C基因型與增加胃癌患病風險相關(guān)(OR=2.64，95%CI：1.73～4.02，P<0.000 1)；rs3744935位點的C/T和T/T基因型也與增加胃癌患病風險相關(guān)(OR=1.58，95%CI： 1.04～2.41，P=0.033)；而rs8708位點的C/T和C/C基因型與降低胃癌患病風險具有相關(guān)性(OR=0.42，95%CI：0.28～0.63，P<0.000 1)。

2.4候選SNP單體型與胃癌風險的相關(guān)性對所選擇的7個SNP位點進行進一步的連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單體型。結(jié)果顯示位于JAG1基因上的rs8708和rs7828兩個位點具有強連鎖關(guān)系(圖1)。經(jīng)過分析單體型與胃癌風險相關(guān)性，結(jié)果顯示CA單體型與降低胃癌患病風險具有相關(guān)性(OR=0.18，95%CI：0.13～0.44，P<0.000 1，表4)。

3 討 論

本研究共選取7個位于不同基因上的miR-21靶SNP位點并檢測其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SPRY1基因上rs300574位點的等位基因“C”、Bcl-2基因上rs3744935位點的等位基因“T”和JAG1基因上rs8708位點的等位基因“C”與胃癌患病風險具有相關(guān)性。該結(jié)果首次揭示了miR-21靶SNP位點與胃癌患病風險之間的相關(guān)性，為后續(xù)深入研究miR-21與胃癌發(fā)生的具體機制提供了新線索。

圖1JAG1基因上4個候選SNP的連鎖不平衡圖

Fig.1 Linkage disequilibrium of four candidates SNPs inJAG1 gene

miRNA是一類新的非編碼RNA，通過抑制翻譯或切割/衰減mRNA而調(diào)控靶基因的表達[13]。全基因組研究顯示，miRNA基因通常位于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域或脆性位點，以及雜合性缺失或擴增的最小區(qū)域，或共同的斷點區(qū)域，表明miRNA在腫瘤發(fā)生中的潛在作用。在不同類型的腫瘤如乳腺癌、白血病以及肺癌和結(jié)腸癌中，也通常存在miRNA的異常表達[14]，這表明miRNA與人類惡性腫瘤密切相關(guān)。CHAN等[15]報道m(xù)iR-21在人類膠質(zhì)母細胞瘤中的表達明顯升高，并且通過阻斷關(guān)鍵凋亡相關(guān)基因的表達而促進了惡性表型的形成。SI等[16]發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺腫瘤中高度表達，并且antimiR-21介導(dǎo)的細胞生長抑制與細胞凋亡增加和增殖減少具有相關(guān)性。也有報道m(xù)iR-21在惡性膽管細胞中過度表達；抑制miR-21可增加個體對吉西他濱的敏感性[17]。另外，在大規(guī)模miRNA芯片檢測中，VOLINIA等[18]觀察到胃癌等多種實體腫瘤中miR-21的過度表達。但是，miR-21在胃癌發(fā)生中的作用和相關(guān)途徑卻不清楚。本研究通過對miR-21靶位點的不同基因型的分析檢測，表明miR-21的靶位點rs300574、rs3744935和rs8708的多態(tài)性可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展之間存在相關(guān)性，這也提示SPRY1、Bcl-2和JAG1的基因多態(tài)性可能與胃癌風險之間存在相關(guān)性。

表3候選SNP在遺傳模型下與胃癌風險的相關(guān)性

Tab.3 Association between candidate SNPs and the risk of GC in genetic model

SNP模型基因型對照組[n(%)](n=300)病例組[n(%)](n=300)OR(95% CI) Prs300574共顯性T/T153(51.1)88(29.2)1T/C118(39.4)162(54.3)2.52(1.62～-3.92)C/C29(9.5)50(16.5)3.10(1.61～5.98)<0.0001顯性T/T153(51.1)88(29.2)1T/C-C/C147(48.9)212(70.8)2.64 (1.73～4.02)<0.0001隱性T/T-T/C271(90.5)250(83.5)1C/C29(9.5)50(16.5)1.85(1.01～3.39)0.042加性---1.95(1.43～2.66)<0.0001rs4272共顯性A/A243(81)234(77.9)1G/A51(16.9)61(20.6)1.30(0.78～2.16)G/G6(2.1)5(1.5)0.87(0.20～3.69)0.059顯性A/A243(81)234(77.9)1G/A-G/G57(19)66(22.1)1.25(0.76～2.04)0.380隱性A/A-G/A294(97.9)295(98.5)1G/G6(2.1)5(1.5)0.82(0.19～3.50)0.790加性---1.17(0.76～1.79)0.490rs4728共顯性A/A164(54.6)166(55.4)1C/A116(38.7)118(39.3)1.02(0.67～1.55)C/C20(6.7)16(5.2)0.80(0.34～1.88)0.860顯性A/A164(54.6)166(55.4)1C/A-C/C136(45.4)134(44.6)0.99(0.66～1.47)0.950隱性A/A-C/A280(93.3)284(94.8)1C/C20(6.7)16(5.2)0.79(0.34～1.83)0.580加性---0.96(0.69～1.33)0.790rs11911共顯性A/A104(34.5)84(28.1)1C/A144(48.2)152(50.6)1.46(0.93～2.31)C/C52(17.2)64(21.4)1.52(0.85～2.72)0.200顯性A/A104(34.5)84(28.1)1C/A-C/C196(65.5)216(71.9)1.48(0.96～2.27)0.073SNP模型基因型對照組[n(%)](n=300)病例組[n(%)](n=300)OR(95% CI) Prs11911隱性A/A-C/A248(82.8)236(78.7)1C/C52(17.2)64(21.4)1.21(0.72～2.01)0.470加性---1.26(0.95～1.68)0.110rs3744935共顯性C/C215(71.7)176(58.8)1C/T81(26.9)108(36.0)1.48(0.96～2.28)T/T4(1.4)16(5.2)3.27(0.90～11.88)0.047顯性C/C215(71.7)176(58.8)1C/T-T/T85(28.3)124(41.2)1.58(1.04～2.41)0.033隱性C/C-C/T296(98.6)284(94.8)1T/T4(1.4)16(5.2)2.88(0.80～10.38)0.082加性---1.57(1.08～2.28)0.036rs8708共顯性T/T131(43.7)193(64.4)1C/T138(46.1)93(31.1)0.45(0.30～0.70)C/C31(10.2)14(4.5)0.25(0.11～0.59)<0.0001顯性T/T131(43.7)193(64.4)1C/T-C/C169(56.3)107(35.6)0.42(0.28～0.63)<0.0001隱性T/T-C/T269(89.8)286(95.5)1C/C31(10.2)14(4.5)0.35(0.16～0.80)0.011加性---0.48(0.34～0.67)<0.0001rs7828共顯性A/A203(67.6)208(69.3)1C/A92(30.6)86(28.8)0.91(0.59～1.41)C/C5(1.8)6(1.9)0.48(0.11～2.07)0.590顯性A/A203(67.6)208(69.3)1C/A-C/C97(32.4)92(30.7)0.88(0.58～1.35)0.560隱性A/A-C/A295(98.2)294(98.1)1C/C5(1.8)6(1.9)0.50(0.12～2.11)0.350加性---0.86(0.58～1.26)0.430

表4JAG1基因候選SNP的單體型與胃癌風險的相關(guān)性

Tab.4 Association between haplotype of SNP inJAG1 and the risk of GC

SNPrs8708rs7828對照組(n=300)病例組(n=300)OR (95% CI)PTA0.7990.6601.00-CC0.1620.1630.86(0.55～1.43) 0.4500CA0.0380.1690.18(0.13～0.44)<0.0001

SPRY1基因位于人類染色體4q28.1區(qū)域，是RAS信號通路上游的一個拮抗物。RAS基因是在各種癌癥中突變頻率最高的基因，其突變引起SPRY1基因過表達，而SCHAAF等[19]發(fā)現(xiàn)在RAS基因突變時，作為RAS信號通路的拮抗劑的SPRY1卻轉(zhuǎn)為激活劑作用。SPRY1基因多態(tài)性與肥胖和骨質(zhì)疏松具有相關(guān)性，而有關(guān)SPRY1基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的文獻信息較少，本研究首次發(fā)現(xiàn)SPRY1基因上rs300574位點的等位基因“C”與增加胃癌風險相關(guān)，后續(xù)應(yīng)進一步用功能實驗驗證其在相關(guān)通路中的機制及作用。

Bcl-2基因位于人類染色體18q21.33區(qū)域，所編碼的外線粒體膜蛋白具有抑制細胞凋亡的作用。PARKER等[20]研究報道Bcl-2相關(guān)蛋白引發(fā)的過度凋亡和促凋亡作用與低風險的骨髓增生異常綜合癥具有相關(guān)性。而一項國際合作項目表明MYC /Bcl-2蛋白共表達導(dǎo)致彌漫大B細胞淋巴瘤患者的低生存率和高患病風險[21]。KONTUREK等[22]在胃癌中觀察到Bax/Bcl-2系統(tǒng)失調(diào)，并且Bcl-2顯著上調(diào)。本研究首次發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因上rs3744935位點的等位基因“T”與增加胃癌風險相關(guān)，進一步說明Bcl-2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。

JAG1基因位于人類染色體20p12.2區(qū)域，由JAG1編碼的jagged 1蛋白是果蠅jagged蛋白的人類同源物。已有報道JAG1的突變會引起Alagille綜合癥。JAG1是Notch的配體，而Notch信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[23]。而本研究發(fā)現(xiàn)JAG1基因上rs8708位點的等位基因“C”與降低胃癌的患病風險具有相關(guān)性，這與之前研究結(jié)果一致，然而其涉及到的具體作用機制還有待進一步探索。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-21靶位點rs300574、rs3744935和rs8708的多態(tài)性可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展之間存在相關(guān)性。這為臨床上胃癌的早期診斷與預(yù)防提供了新的候選基因位點，也為后續(xù)深入研究miR-21參與胃癌發(fā)病機制提供線索。