孫文伶，趙麗娜，董 陽(yáng)，劉 暢，馬 玲*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

近年來(lái)，酸奶已成為人們生活中一種常見(jiàn)的乳制品，受到了消費(fèi)者的青睞并且需求量不斷增長(zhǎng)[1]。除了與其良好的風(fēng)味、口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有關(guān)之外，還與其中含有的乳酸菌可以調(diào)節(jié)人體生理功能有關(guān)。酸奶中的乳酸菌（Lactobacillus）是健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長(zhǎng)、繁殖，調(diào)整腸道菌群平衡，抑制并清除腸道中對(duì)人具有潛在危害的細(xì)菌。因此提高酸乳中乳酸菌的密度成為研究熱點(diǎn)，成為傳統(tǒng)食品發(fā)展方向[2]。

高密度培養(yǎng)技術(shù)（high cell density culture，HCDC），是指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有10倍以上顯著提高[3]，可以縮短生產(chǎn)時(shí)間、減少設(shè)備投資，降低生產(chǎn)成本，從而極大地提高產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[4]。篩選優(yōu)良菌株是制備酸奶發(fā)酵劑的基礎(chǔ)[5]。因乳酸菌在產(chǎn)品發(fā)酵及冷藏過(guò)程中易受到損害，導(dǎo)致數(shù)量大大減少，高密度培養(yǎng)乳酸菌對(duì)工業(yè)生產(chǎn)及產(chǎn)品研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義[6]。有研究表明[7-8]，影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的因素主要有以下幾個(gè)方面：培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)模式及培養(yǎng)過(guò)程中抑制性代謝產(chǎn)物的調(diào)控等。國(guó)內(nèi)外已有乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化或改良、增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化或改良、添加各種促生長(zhǎng)的提取物、添加維生素、鹽或植物蛋白作為增殖因子等手段來(lái)調(diào)配培養(yǎng)基成分或性質(zhì)使其菌體達(dá)到高密度的目的。吳祖芳等[9]通過(guò)添加番茄汁培養(yǎng)菌株LactobacillusH17，得出其明顯有促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用，胡蘿卜提供維生素，牛奶是乳酸菌生長(zhǎng)的天然基質(zhì)。國(guó)外在乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)上已經(jīng)很成熟并應(yīng)用在生產(chǎn)中，而國(guó)內(nèi)在這方面還沒(méi)有較成熟的體系，有基礎(chǔ)研究的報(bào)道但很少得到應(yīng)用。

本試驗(yàn)對(duì)普通酸奶發(fā)酵劑的培養(yǎng)方法進(jìn)行改良，在乳酸菌發(fā)酵后期加入適當(dāng)比例及含量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（胡蘿卜汁、番茄汁、乳清等）以及牛乳改變培養(yǎng)基組分以獲得高密度發(fā)酵菌種。對(duì)高密度菌種與非高密度菌種發(fā)酵所得酸奶的菌落總數(shù)、保水性、黏度、pH、滴定酸度、穩(wěn)定性、風(fēng)味的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，為發(fā)展高密度菌種制作酸奶奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后工業(yè)化生產(chǎn)不同類型的產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

混合乳酸菌種（保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus））：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

鮮牛乳（新鮮、無(wú)抗）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；番茄、胡蘿卜：市售；乳清：自制奶酪后所得。

1.1.2 化學(xué)試劑

Na2CO3（分析純）：蕭縣化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀、葡萄糖（均為分析純）：天津市北辰方正試劑廠；乙酸鈉、吐溫80、MgSO4、MnSO4（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；β-磷酸甘油二鈉（分析純）：北京Solarbio科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 mL、MgSO40.58 g、MnSO40.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。121℃滅菌15 min。

M17培養(yǎng)基：酪蛋白的胰蛋白酶消化物2.5 g、肉的胃蛋白酶消化物2.5 g、大豆的木瓜酶消化物5.0 g、酵母提取物2.5 g、β-磷酸甘油二鈉10 g、牛肉膏5 g、硫酸鎂0.25 g、抗壞血酸0.5 g、蒸餾水950 mL。121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

NDJ-1指針式黏度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HPP-9272恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LD5-2B低速離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FE28-Standard pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Trace 1300-ISO氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶加工工藝流程

（1）高密度乳酸菌發(fā)酵劑的制備

鮮牛奶（新鮮，無(wú)抗）→滅菌（121℃、30 min）→冷卻（40℃）→接種（3%，V/V）→攪拌→灌裝→發(fā)酵（42℃，2.5 h）→調(diào)節(jié)pH（當(dāng)牛奶的pH降低至4.6時(shí)，加入濾膜除菌的15%碳酸鈉使其pH達(dá)到6.6）→添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（番茄汁∶胡蘿卜汁∶乳清∶鮮牛奶=1∶1∶1∶1）→發(fā)酵（4 h，乳酸菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL）

（2）高密度乳酸菌酸奶的制備

鮮牛奶（新鮮，無(wú)抗）→加糖→殺菌（95℃、5～10 min）→冷卻（40℃）→接種高密度乳酸菌發(fā)酵劑（3%，V/V）→攪拌→灌裝→發(fā)酵（42℃，4～5 h）→冷藏→后熟→成品

1.3.2 分析檢測(cè)

采用吳祖芳等[9]研究方法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)；使用黏度計(jì)及pH計(jì)測(cè)定酸奶的黏度及pH值；采用陳岑等[10]研究的酸堿滴定法測(cè)定酸奶酸度。

（1）穩(wěn)定性的測(cè)定[11]

將靜置24 h后的酸奶樣品稀釋80倍，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定樣品的吸光度值A(chǔ)1；然后取酸奶50 mL，4 000 r/min離心10min，取上層乳液在波長(zhǎng)540nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)2。酸奶穩(wěn)定性R（R值越大懸浮穩(wěn)定性越好）計(jì)算公式如下：

（2）保水性的測(cè)定[12-13]

取一定量酸奶于離心管中，稱量離心管的質(zhì)量m1和酸奶與離心管的質(zhì)量m2，以3 500 r/min離心10 min，除去上清液，稱量離心后的酸奶和離心管質(zhì)量m3。酸奶穩(wěn)定性S計(jì)算公式如下：

（3）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定[14]

樣品前處理：固相微萃取（solid-phasemicro-extraction，SPME）萃取酸奶中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，萃取50 min，250℃解吸附3 min。

氣相色譜條件：HP5973色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）。采用程序升溫方式，初始溫度35℃，保持3min；再以4℃/min升至140℃，保持1 min；再以10℃/min升至250℃；再保持3min；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，E1）源，電子能量70 eV；發(fā)射電流100 μA；離子源溫度為230℃；質(zhì)譜掃描范圍33～450 amu。

定性定量方法：參考相關(guān)文獻(xiàn)資料及標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行檢索，定性化合物，按照每一組分峰面積占總峰面積的百分比定量。

（4）酸奶的感官評(píng)價(jià)

評(píng)定小組由10位有食品評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人員組成，對(duì)酸奶的外觀、氣味、口感、組織狀態(tài)、酸甜度進(jìn)行評(píng)價(jià)；各項(xiàng)滿分各為20分，各項(xiàng)評(píng)分值的和為感官評(píng)價(jià)總分，滿分100分，酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 酸奶樣品感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of yogurt samples

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的對(duì)比

酸奶中最重要的成分為乳酸菌，其數(shù)量直接影響酸奶的品質(zhì)以及酸奶對(duì)人體的生理功能。將高密度與非高密度酸奶分別取樣，在培養(yǎng)溫度為42℃的MRS培養(yǎng)基與M17培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每隔3 d取酸奶樣培養(yǎng)記錄一次，所得16 d內(nèi)兩種酸奶中菌落總數(shù)隨時(shí)間的變化如圖1所示。

圖1 兩種酸奶菌落總數(shù)隨放置時(shí)間的變化Fig.1 Changes of total numbers of colony in two kinds of yogurts during storage

由圖1可知，隨著放置時(shí)間（0～16 d）的延長(zhǎng)，高密度與非高密度酸奶的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值均不斷下降（從8.71和8.53下降至8.23和8.03），但高密度酸奶的菌落總數(shù)高于非高密度酸奶的菌落總數(shù)。這可能是由于在高密度酸奶的菌種的培養(yǎng)后期加入了碳酸鈉，使得由于不斷產(chǎn)生的乳酸降低的培養(yǎng)液pH值得到回升。因pH值＜4時(shí)會(huì)嚴(yán)重抑制菌體的生長(zhǎng)[15]，因此加入碳酸鈉起到了一定的緩沖作用，使得培養(yǎng)環(huán)境更適合菌體生長(zhǎng)。此外，在培養(yǎng)的后期加入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使培養(yǎng)基成分得以補(bǔ)充，菌體生長(zhǎng)可利用的營(yíng)養(yǎng)成分增加，有利于菌體的生長(zhǎng)，從而使高密度菌種中單位體積包含更多的乳酸菌細(xì)胞數(shù)，相應(yīng)的由高密度菌種制作的酸奶中乳酸菌的數(shù)量也較非高密度酸奶高。

2.2 滴定酸度和pH值的對(duì)比

滴定酸度和pH值是酸奶的重要指標(biāo)，與酸奶品質(zhì)有很大的關(guān)系。高密度與非高密度酸奶的pH值及酸度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)結(jié)果如圖2所示。

圖2 兩種酸奶pH值（A）和滴定酸度（B）在貯藏過(guò)程中的變化Fig.2 Changes of pH value(A)and titration acidity(B)of two kinds of yogurts during storage

由圖2可知，兩種酸奶的pH值均隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。1～4 d的時(shí)候下降比較緩慢，4～7 d時(shí)迅速下降，之后下降趨于平緩，在這期間高密度酸奶的pH值一直稍低于非高密度酸奶。而滴定酸度的變化趨勢(shì)正好與pH值相反，但變化規(guī)律一致?？赡苁且?yàn)樗崮淘趦?chǔ)存過(guò)程中保加利亞乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵乳糖，導(dǎo)致后酸化，導(dǎo)致pH值逐漸降低[16]。各個(gè)發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力不同導(dǎo)致酸奶pH值和酸度的變化差異[17-18]。而到后期隨著酸度增加抑制了菌的活性，產(chǎn)酸速度下降，從而pH值和滴定酸度的變化趨于平緩。由于高密度酸奶中菌落總數(shù)較非高密度酸奶中多，因此在后期放置過(guò)程中高密度酸奶的滴定酸度總是高于非高密度酸奶。

2.3 黏度、穩(wěn)定性及保水性的對(duì)比

黏度、穩(wěn)定性和保水性是酸奶重要的物理學(xué)特性，反映了酸奶的品質(zhì)。高密度與非高密度酸奶的黏度、穩(wěn)定性及保水性隨時(shí)間的變化如圖3所示。

圖3 兩種酸奶黏度（A）、穩(wěn)定性（B）及保水性（C）在貯藏過(guò)程中的變化Fig.3 Change of viscosity(A),stability(B)and water retention(C)of two kinds of yogurts during storage

由圖3可知，在試驗(yàn)期間，兩種酸奶的黏度一直在下降。儲(chǔ)藏7 d黏度下降速度較快，之后下降速度趨于平緩。且在整個(gè)期間高密度酸奶的黏度一直稍低于非高密度酸奶。保水性和穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)和黏度的一致?？赡苁且?yàn)榘l(fā)酵劑菌種產(chǎn)生的蛋白酶在發(fā)酵結(jié)束以后繼續(xù)作用并催化底物蛋白，同時(shí)酸奶在儲(chǔ)存期間酸度逐漸降低，達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，酪蛋白膠粒進(jìn)一步進(jìn)行聚集沉降[19-20]，這兩方面會(huì)引起酸乳中微小蛋白質(zhì)亞膠體分子團(tuán)改變，使得他們之間的親合連接作用減弱，進(jìn)而引起酸乳膠體的剛性降低和膠體分子團(tuán)聚集成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散，導(dǎo)致酸奶的穩(wěn)定性下降，結(jié)果使酸乳的黏度降低、保水性下降[21-22]。高密度酸奶的穩(wěn)定性（0.06～0.29）、黏度（1.53～4.23）和保水性（0.455～0.813）均與非高密度酸奶穩(wěn)定性（0.20～0.35）、黏度（1.73～4.38）和保水性（0.407～0.575）相差不大（P＞0.05）。

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的對(duì)比

采用GC-MS法對(duì)高密度和非高密度酸奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，高密度與非高密度酸奶樣品中各類揮發(fā)性成分種類及所占的相對(duì)含量分析如圖4所示。

圖4 兩種酸奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（A）及相對(duì)含量（B）Fig.4 Kinds(A)and relative contents(B)of volatile flavor components in two kinds of yogurts

由圖4可知，高密度與非高密度酸奶中有很多種風(fēng)味物質(zhì)，其風(fēng)味特征是酮、酸、酯、醛、醇等綜合作用的結(jié)果[23]。高密度酸奶中共檢測(cè)到24種化合物，非高密度酸奶中共檢測(cè)到20種化合物，都是乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的。兩種酸奶中高密度酸奶所含酸類物質(zhì)種類多，除了乙酸、己酸外還有辛酸，且相對(duì)含量較非高密度的高。酮類物質(zhì)中，高密度酸奶的3-羥基-2-丁酮含量較高，酸奶產(chǎn)生的奶味濃醇。相比較而言，高密度酸奶的酯和酮等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量較高，其中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量為0.52%遠(yuǎn)高于非高密度酸奶的0.41%，而酮類物質(zhì)的相對(duì)含量為0.048%高于非高密度酸奶的0.012%，這些風(fēng)味物質(zhì)使得酸奶的風(fēng)味更加誘人，風(fēng)味物質(zhì)對(duì)酸奶的風(fēng)味協(xié)調(diào)性和風(fēng)味強(qiáng)度均有不同程度的影響作用[24-25]。

2.5 感官評(píng)價(jià)

由圖5可知，相比較而言高密度酸奶具有較好的感官特性。高密度酸奶的色澤均勻一致、有濃郁的風(fēng)味、口感細(xì)膩酸甜可口且狀態(tài)穩(wěn)定，幾乎無(wú)乳清析出，黏度適宜。因此，各項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)分較高。非高密度酸奶的口感和組織狀態(tài)與高密度的相差不大，在酸甜度等方面可能因?yàn)楦呙芏人崮坍a(chǎn)酸較多，因此更可口。在儲(chǔ)藏期內(nèi)，高密度酸奶的感官評(píng)分始終高于非高密度酸奶。其中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的醛類、酯類、酮類物質(zhì)的含量均高于非高密度酸奶，可能因?yàn)楦呙芏人崮讨械娜樗峋鷶?shù)量較高，其儲(chǔ)藏過(guò)程中代謝形成了更多的酶，這些酶催化反應(yīng)形成了更多的風(fēng)味物質(zhì)。

圖5 兩種酸奶感官評(píng)分在貯藏過(guò)程中的變化Fig.5 Changes of sensory evaluation of two kinds of yogurts during storage process

3 結(jié)論

應(yīng)用化學(xué)中和法結(jié)合補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法制作高密度乳酸菌發(fā)酵劑，并對(duì)高密度乳酸菌發(fā)酵劑和非高密度乳酸菌發(fā)酵制作的酸奶在放置過(guò)程中的菌落數(shù)、酸度、保水性、穩(wěn)定性、黏度、感官評(píng)價(jià)以及風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，高密度菌種發(fā)酵制備的酸奶菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值、滴定酸度及感官評(píng)分均高于非高密度菌種發(fā)酵制備的酸奶，而二者pH值、黏度、穩(wěn)定性、保水性相差不大。高密度與非高密度菌種發(fā)酵酸奶中共檢測(cè)風(fēng)味化合物分別為24、20種，其中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量分別為0.52%、0.41%，酮類物質(zhì)的相對(duì)含量分別為0.048%、0.012%。綜上，高密度酸奶各方面均優(yōu)于非高密度酸奶，為今后研究高密度酸奶提供了依據(jù)，可以在進(jìn)一步完善相關(guān)工藝的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)系列高密度酸奶產(chǎn)品。