郭金玲，張丹陽(yáng)，樊雪蓮，呂育財(cái)，田毅紅，龔大春

（1.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是多年生經(jīng)濟(jì)作物魔芋（Amorophophallus konjac）的主要活性成分，由D-甘露糖和D-葡萄糖通過(guò)β-1,4-D-糖苷鍵按1.6∶1的物質(zhì)的量比例連接而成，在甘露糖和葡萄糖殘基的C3位置存在分支[1]。KGM為水溶性膳食纖維，有輔助醫(yī)療和保健作用，是一種優(yōu)良的食品添加劑[2]。然而，由于其分子量大（可達(dá)105～106）[3]，具有遇水后高膨脹、高黏度的特性，過(guò)量攝入將引起抗?fàn)I養(yǎng)作用，從而使其應(yīng)用受到限制。KGM水解產(chǎn)物魔芋低聚糖不僅水溶性高，還具有改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制病原菌生長(zhǎng)、降低血清總膽固醇及甘油三酯水平和減少有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等重要生理功能，成為新一代功能性食品[4]。因此，對(duì)KGM的水解改性研究成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

β-甘露聚糖酶是一類可以水解β-1,4-D-甘露糖苷鍵的內(nèi)切型水解酶，能夠?qū)GM水解為由2～10個(gè)單糖分子連接而成的魔芋低聚糖，細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌均有產(chǎn)β-甘露聚糖酶的能力[4-5]。目前，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬（Bacillus）和霉菌中的曲霉屬（Aspergillus）成為已報(bào)道的β-甘露聚糖酶的主要來(lái)源，研究主要集中在新的產(chǎn)酶微生物的發(fā)現(xiàn)、新酶的結(jié)構(gòu)表征、酶的表達(dá)與改造等方面[6-11]。雖然β-甘露聚糖酶來(lái)源廣泛、數(shù)量眾多，但由于KGM溶于水后分子鏈伸展，黏度非常大，在β-甘露聚糖酶催化其水解的過(guò)程中，KGM濃度仍然比較低，導(dǎo)致了酶解產(chǎn)物后處理成本高、生產(chǎn)效率低[12]。因此，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)能夠在高底物濃度下快速水解KGM制備魔芋低聚糖的β-甘露聚糖酶具有重要意義。

本研究以魔芋粉為唯一碳源，從土壤中定向篩選可高效降解KGM為魔芋低聚糖的微生物，并對(duì)產(chǎn)酶微生物進(jìn)行鑒定，研究其水解KGM的工藝條件，為實(shí)現(xiàn)魔芋低聚糖的高效制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：采自湖北省宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)縣魔芋種植地土壤。

1.1.2 試劑

魔芋膠（KGM含量≥95%）：湖北一致魔芋生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（純度＞98%）：上海源聚生物科技有限公司；薄層硅膠板G型（50 mm×100 mm）：青島海浪硅膠干燥劑有限公司；甘露糖（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：魔芋粉3.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgCl20.2 g/L，KH2PO41.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：魔芋粉10.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；鐳磁PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SX-700蒸汽滅菌器：日本Tomy公司；SW-CT-1D型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；MX-307落地高速冷凍離心機(jī)：日本Tomy公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶微生物的篩選

（1）初篩：稱取5.0 g土樣加入45 mL無(wú)菌水中，搖床振蕩20 min，使土壤中微生物充分混于水中，靜置15 min。取1 mL上清液于無(wú)菌具塞試管中，加入9 mL無(wú)菌水，搖勻后依次梯度稀釋至10-5。分別吸取10-3、10-4和10-5三個(gè)稀釋度的菌懸液0.2 mL涂布于初篩培養(yǎng)基上，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，0.1%剛果紅溶液染色10 min后觀察水解圈大小，挑取水解圈與菌落直徑之比較大的菌株純化后置于4℃冰箱保存。

（2）復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后按1%（V/V）接種量接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于相同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。分別測(cè)定各菌株的β-甘露聚糖酶活力，篩選出β-甘露聚糖酶活力最高的出發(fā)菌株。

1.3.2 菌種G1的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[13-14]測(cè)定菌株G1的革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、尿素利用、明膠水解、淀粉水解、生長(zhǎng)pH范圍、耐受鹽濃度和糖發(fā)酵試驗(yàn)等生理生化指標(biāo)。

（2）分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定由上海生物工程有限公司完成，序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（nationalcenterforbiotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行Blast搜索，選取同源性較高菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 魔芋低聚糖制備工藝條件的優(yōu)化

魔芋低聚糖的制備工藝：用pH為4.5～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的KGM底物溶液，加入不同添加量（酶添加量用酶活力（U）與底物含量（g）來(lái)表示，U/g KGM）的β-甘露聚糖酶，于不同的恒溫水浴鍋中酶解。

制備工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)：以還原糖轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素輪換法考察酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶解pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶添加量（2 U/g、5 U/g、10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g）、底物濃度（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）以及不同底物質(zhì)量濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L）條件下酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7h、8 h、9 h和10 h）對(duì)魔芋低聚糖制備的影響，初始條件為pH 6.5，底物濃度10 g/L，酶添加量50 U/g，酶解時(shí)間2 h。

1.3.4 檢測(cè)方法

（1）β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定

甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.2 g/L甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取6支10 mL刻度試管，分別加入甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，蒸餾水2.5mL、2.0mL、1.5 mL、1.0mL、0.5mL、0，混勻后加入DNS2.5mL，于沸水浴中煮沸7min后迅速冷卻，加入蒸餾水補(bǔ)足至10mL，以空白組調(diào)零，于波長(zhǎng)540 nm條件下測(cè)定吸光度值，以甘露糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

y=1.738x-0.141 8（R2=0.999 1）。

β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[15]，取A、B兩支刻度試管，分別向其中加入2.4 mL、pH 5.5 KGM（5.0 g/L）溶液，于50℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，在A管中加入0.1 mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的粗酶液，B管不加酶液。50℃水浴條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即分別向試管A和B中加入2.5mLDNS試劑，終止反應(yīng)。再向B管中補(bǔ)加0.1 mL上述酶液，沸水中煮沸反應(yīng)7 min，待冷卻后向各管加入去離子水5 mL，搖勻，以B管為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)量A管吸光度值（A540nm）。依據(jù)甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出溶液中生成的還原糖量（mg），再計(jì)算得到酶活。β-甘露聚糖酶酶活力定義：在上述條件下，每1 min產(chǎn)生1 μmol還原糖（以甘露糖為準(zhǔn)）的酶量定義為1個(gè)甘露聚糖酶活力單位（U）。

（2）還原糖轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

樣品還原糖轉(zhuǎn)化率的測(cè)定：分別取適當(dāng)稀釋的酶解樣品及空白（KGM底物溶液）于10 mL刻度試管中，按甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測(cè)定酶解樣品液的吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)，由甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖的量，并計(jì)算還原糖轉(zhuǎn)化率，其計(jì)算公式如下：

（3）酶解產(chǎn)物的定性檢測(cè)

采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法根據(jù)各物質(zhì)的比移值對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。將KGM（10 g/L）溶液及在最佳工藝條件下酶解1 h和2 h的KGM（10g/L）酶解液于沸水浴中煮沸5min，8000r/min離心10min后的上清液分別點(diǎn)樣到G型硅膠板（50 mm×100 mm）上，標(biāo)準(zhǔn)品為甘露糖和甘露三糖。點(diǎn)樣后置于正丁醇∶冰乙酸∶水的體積比為12∶6∶6的展層劑中展層，展層結(jié)束后，將硅膠板取出吹干，用噴霧器均勻淋?chē)姳桨?二苯胺-磷酸顯色劑，于100℃烘箱顯色15 min[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶微生物的篩選與鑒定

2.1.1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶微生物的篩選

圖1 菌株G1在初篩培養(yǎng)基平板上對(duì)魔芋葡甘聚糖的降解效果Fig.1 The degradation effect of strain G1 on konjac glucomannan on the primary screening medium plate

采用以魔芋粉為唯一碳源的培養(yǎng)基，經(jīng)剛果紅染色初篩和發(fā)酵復(fù)篩，從湖北省宜昌市魔芋地土壤中分離出一株水解圈與菌落直徑之比較大（比值為2.3）、酶活性較高（70.1U/mL）的菌株，編號(hào)為G1，其在初篩培養(yǎng)基上對(duì)KGM的降解效果如圖1所示。

2.1.2 菌株G1的鑒定

菌株G1的形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。

表1 菌株G1的生理生化性質(zhì)Table 1 Physiological and biochemical characterizations of strain G1

圖2 基于16S rDNA序列分析的菌株G1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain G1 based on 16S rDNA sequence analysis

由表1可知，菌株G1呈革蘭氏陽(yáng)性，具有不能利用尿素，可水解淀粉和明膠，能耐受90 g/L鹽濃度等性質(zhì)。由圖2可知，該菌株G1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，同源性＞99%，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株G1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 魔芋低聚糖制備工藝條件優(yōu)化

2.2.1 酶解溫度對(duì)魔芋低聚糖制備的影響

酶解溫度對(duì)魔芋低聚糖制備的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在溫度為40～55℃之間時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高呈上升趨勢(shì)；溫度為55℃時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值（51.2%）；在55℃之后，還原糖的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高明顯下降，分析原因可能是由于高溫引起酶活力損失，導(dǎo)致酶解能力下降[17]。因此，確定55℃為最佳酶解溫度。此結(jié)果與SRIVASTAVA P K等[5]報(bào)道的Bacillus屬β-甘露聚糖酶的最適溫度相符。

圖3 酶解溫度對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the conversion ratio of reducing sugar

2.2.2 酶解pH值對(duì)魔芋低聚糖制備的影響

不同酶解pH值對(duì)魔芋低聚糖制備影響的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解pH值對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on the conversion ratio of reducing sugar

由圖4可知，當(dāng)酶解pH值為4.5～6.5時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率隨pH值的增大而增加；pH值為6.5時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高（51.3%）；當(dāng)pH值＞6.5之后，還原糖轉(zhuǎn)化率隨pH值的增大而降低；當(dāng)pH為8.0時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率仍然可達(dá)到42.4%。通常，隨著酶解pH值偏離最適pH值酶解效率會(huì)明顯下降[17-18]。本研究中的β-甘露聚糖酶在pH 4.5～8.0范圍內(nèi)均具有較好的轉(zhuǎn)化效果，說(shuō)明對(duì)pH具有較強(qiáng)的耐受性。最終確定KGM酶解的最適pH值為6.5，與何丹等[18]報(bào)道的酶法制備魔芋甘露寡糖的最適pH值一致。

2.2.3 酶添加量對(duì)魔芋低聚糖制備的影響

β-甘露聚糖酶添加量對(duì)魔芋低聚糖制備的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，酶添加量為2～50 U/g時(shí)，隨著β-甘露聚糖酶添加量的增加，還原糖的轉(zhuǎn)化率迅速增加，由9.0%增加至51.5%；當(dāng)加酶量達(dá)到50 U/g以后，還原糖的轉(zhuǎn)化率的增加緩慢，且與50 U/g的加酶量時(shí)還原糖的轉(zhuǎn)化率差異不顯著（P＞0.05）?？紤]到使用成本，選擇50 U/g為最佳酶添加量。目前，已報(bào)道的工藝中酶添加量大多在50～250 U/g，本研究與其處于同一水平[12，15，17-18]。

圖5 酶添加量對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the conversion ratio of reducing sugar

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)魔芋低聚糖制備的影響

底物質(zhì)量濃度對(duì)魔芋低聚糖制備的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 魔芋葡甘聚糖濃度對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of konjac glucomannan concentration on the conversion ratio of reducing sugar

由圖6可知，在GM質(zhì)量濃度為5～10 g/L時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率增加不顯著（P＞0.05）；還原糖的轉(zhuǎn)化率在KGM質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)達(dá)到最大（51.6%）；繼續(xù)增加KGM濃度時(shí)，還原糖的轉(zhuǎn)化率隨之降低，當(dāng)KGM質(zhì)量濃度為30g/L時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率下降至35.9%。這主要是由于魔芋膠吸水性強(qiáng)，隨著底物濃度的增大，黏度迅速增加，嚴(yán)重阻礙酶對(duì)底物的充分水解，同時(shí)也限制了可溶性還原糖的釋放，因此，還原糖轉(zhuǎn)化率下降[15]。然而，本實(shí)驗(yàn)中篩選的β-甘露聚糖酶對(duì)30 g/L的KGM底物仍具有較好的轉(zhuǎn)化效果（35.9%），酶解2 h后還原糖轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到30%以上，表明來(lái)源于B.subtilisG1的β-甘露聚糖酶具有較好的應(yīng)用前景。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)魔芋低聚糖制備的影響

為了加強(qiáng)高底物濃度下的酶解效果，考察了酶解時(shí)間對(duì)魔芋低聚糖制備的影響。不同底物濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L）條件下，酶解時(shí)間對(duì)魔芋低聚糖制備的影響結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，酶解2 h時(shí)還原糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到51.6%，之后還原糖的轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在50.1%～54.5%范圍內(nèi)；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，酶解時(shí)間為0～4 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖轉(zhuǎn)化率迅速增加，在4 h時(shí)還原糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.5%，4～10 h時(shí)增加速率減慢，由49.5%增加至56.2%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，酶解時(shí)間為0～4 h時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，酶解4h時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到46.9%，之后趨于緩慢增加，由46.9%增加至53.6%。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on the conversion ratio of reducing sugar

由此得出魔芋低聚糖制備的最佳工藝條件為：溫度55℃，pH 6.5，酶添加量50 U/g，KGM質(zhì)量濃度10 g/L時(shí)，酶解時(shí)間為2h，KGM質(zhì)量濃度為20～30g/L，酶解時(shí)間為4h。

2.3 酶解產(chǎn)物的定性檢測(cè)

酶解產(chǎn)物的定性檢測(cè)結(jié)果如圖8所示。

圖8 魔芋葡甘聚糖酶解產(chǎn)物的薄層層析分析Fig.8 Thin layer chromatography of enzymolysis products of konjac glucomannan

由圖8可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，點(diǎn)樣處的顏色逐漸變淺，KGM質(zhì)量濃度為10 g/L，酶解1 h和2 h后的酶解產(chǎn)物主要為三糖及三糖以上的低聚糖。

3 結(jié)論

本研究從魔芋地土壤中定向篩選出了一株高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili）G1。該酶水解魔芋膠制備魔芋低聚糖的工藝條件為：酶添加量50 U/g，酶解pH6.5，酶解溫度55℃；KGM質(zhì)量濃度為10g/L時(shí)，酶解時(shí)間為2 h，還原糖轉(zhuǎn)化率為51.6%；KGM質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，酶解時(shí)間4 h，還原糖轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)到46.9%，表明該酶具有較高的催化效率。通過(guò)薄層層析定性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物主要為三糖及三糖以上的低聚糖。本研究中獲得的β-甘露聚糖酶在制備魔芋低聚糖上表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，為實(shí)現(xiàn)酶法制備魔芋低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。