李芳香，賀國(guó)君，郁建平*，郁建生，時(shí) 偉，張春林

（1.茅臺(tái)學(xué)院，貴州 仁懷 564500；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

酒糟作為我國(guó)傳統(tǒng)釀酒業(yè)最大的副產(chǎn)物，用石油醚從酒糟中提取的脂溶性成分對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用[1]。利用超臨界萃取技術(shù)可以提取啤酒糟中的色素[2]，同時(shí)經(jīng)過(guò)超臨界脫色后的酒糟可以采用醇-堿法提取啤酒糟中的醇溶蛋白[3]。以無(wú)水乙醇為溶劑，采用乙醇熱回流法提取郎酒丟糟中的總酚[4]。酒糟中具有一定含量的有效成分，其萃取液也具有抗菌或抗氧化活性[5]。

以貴州茅臺(tái)酒股份有限公司生產(chǎn)的經(jīng)過(guò)七輪次蒸煮后的廢棄的酒糟為原材料，利用超臨界流體萃取設(shè)備，以裝料系數(shù)、萃取釜溫度、萃取釜壓力、CO2泵頻率、分離釜Ⅰ溫度和分離釜Ⅰ壓力分別為控制變量的條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定以萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳單一變量。然后通過(guò)4因素3水平的正交試驗(yàn)確定超臨界CO2萃取酒糟中呈香呈味物質(zhì)的最佳工藝條件，并驗(yàn)證了最優(yōu)條件。通過(guò)超臨界萃取技術(shù)可以在不添加任何化學(xué)物質(zhì)的基礎(chǔ)上從酒糟中萃取出一定量的呈香呈味物質(zhì)，這些萃取液可以作為調(diào)味液或者增香劑來(lái)作進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒糟：貴州茅臺(tái)酒股份有限公司。

食品級(jí)的高純CO2（純度為99.99%）：貴陽(yáng)市裕鵬貿(mào)易有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HA 121-50-05超臨界萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；TCS-01R百倫斯電子計(jì)價(jià)秤：廈門(mén)百倫斯電子科技有限公司；BCD-118H星星牌變溫冷凍冷藏箱：浙江星星家電股份有限公司；CFC001-4電子緊密天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；202-00鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；New Human純化水系統(tǒng)：Human Corporation；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丟糟處理以及萃取率計(jì)算

試驗(yàn)材料為七輪次產(chǎn)酒后的丟糟，丟糟不經(jīng)過(guò)任何處理，直接用來(lái)作為超臨界萃取的原料。萃取率計(jì)算公式如下：

1.3.2 萃取條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

根據(jù)資料顯示，影響CO2超臨界萃取效果的因素很多，包含裝料系數(shù)、萃取壓力、萃取溫度、CO2泵的頻率、分離釜Ⅰ的溫度、分離釜Ⅰ的壓力等[1-2]。因此本次試驗(yàn)選取萃取壓力、裝料系數(shù)、萃取溫度、CO2流量、分離釜Ⅰ的溫度和分離釜Ⅰ的壓力為主要考察因素，以萃取率為考察指標(biāo)，分別控制變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而可以先確定各因素的合理取值范圍。分離釜Ⅱ的溫度和壓力不可調(diào)節(jié)，隨著環(huán)境的變化而發(fā)生變化。單因素萃取工藝參數(shù)設(shè)置如表1。以下30個(gè)單因素試驗(yàn)均在控制其他因素不變，唯一因素可變的條件下進(jìn)行。

表1 超臨界萃取工藝單因素試驗(yàn)參數(shù)Table 1 Single factor experiments parameters for supercritical extraction technology

在超臨界二氧化碳萃取時(shí)，萃取釜應(yīng)留有適量的空間，以確保酒糟顆粒能與二氧化碳流體充分有效的接觸，從而達(dá)到高效率的萃取[3]。此試驗(yàn)裝置的萃取釜的容積為5 L，原料裝入萃取釜時(shí)，應(yīng)留有一定的空隙，至少應(yīng)離濾網(wǎng)2～3 cm。此萃取釜總裝酒糟的質(zhì)量為2 000 g。當(dāng)萃取釜裝入的原材料較少時(shí)，萃取出來(lái)的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)較少，萃取的成本也比較高，不經(jīng)濟(jì)適用；當(dāng)萃取釜裝入的原材料過(guò)多時(shí)，則無(wú)法達(dá)到高效萃取的目。因此需要對(duì)萃取釜的裝料系數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，以確保達(dá)到高效、經(jīng)濟(jì)的最佳裝料系數(shù)。裝料系數(shù)的計(jì)算公式為：

（2）正交試驗(yàn)方案

對(duì)以上的單因素進(jìn)行考慮，由于超臨界萃取過(guò)程的萃取壓力、萃取溫度、二氧化碳泵頻率和分離釜Ⅰ溫度對(duì)萃取率的影響較大，故以這4個(gè)因素為正交試驗(yàn)的考察因素，以萃取率為主要考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，建立4因素3水平的正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 裝料系數(shù)對(duì)萃取率影響

試驗(yàn)過(guò)程中控制試驗(yàn)的萃取壓力為30 MPa，溫度為40 ℃，CO2泵頻率為24 r/min，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，分離釜Ⅰ的溫度為45℃，分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ溫度維持在35～36℃之間，不用專門(mén)調(diào)節(jié)。裝料系數(shù)分別設(shè)為0.4，0.5，0.6，0.7，0.8。裝料系數(shù)對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 裝料系數(shù)對(duì)萃取率的影響Fig.1 Effect of volume charge coefficient on extraction rate

由圖1可知，隨著萃取釜的裝料系數(shù)的增加，呈香呈味物質(zhì)的萃取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)投入萃取釜的原材料較少時(shí)，裝料系數(shù)會(huì)比較小，CO2流體與酒糟顆粒的接觸面積較大，這有利于二氧化碳流體的傳遞[4]。但是隨著萃取釜裝料系數(shù)的增加，酒糟顆粒相互擠壓密實(shí)，使得二氧化碳的流體的傳遞阻力變大，從而使酒糟與二氧化碳流體的接觸不均勻，不利于流體傳遞，易形成返混，因此隨著裝料系數(shù)的增大萃取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[5]。當(dāng)裝料系數(shù)為0.5時(shí)，萃取率最大。

2.2 萃取溫度對(duì)萃取率影響

CO2處于超臨界狀態(tài)時(shí)的臨界溫度是31.1℃。故試驗(yàn)的萃取溫度不能低于這個(gè)最小數(shù)值，同時(shí)CO2超臨界萃取的物質(zhì)一般為熱敏感性物質(zhì)，設(shè)置萃取釜的溫度在35～60℃之間[7]。試驗(yàn)過(guò)程中控制試驗(yàn)的萃取壓力為30 MPa，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，分離釜Ⅰ的溫度為45℃，CO2泵頻率為24 r/min，裝料系數(shù)為0.5。分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ溫度維持在35～36℃之間，不用調(diào)節(jié)。萃取溫度分別設(shè)為35℃，40℃，45℃，50℃，55℃。不同溫度對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著萃取釜溫度的增加，呈香呈味物質(zhì)的萃取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。隨著萃取釜萃取溫度的升高，二氧化碳流體的密度也隨之降低，CO2流體對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的溶解能力也相應(yīng)下降，萃取率降低；同時(shí)隨著萃取釜溫度的升高，萃取液的熱運(yùn)動(dòng)加快，蒸汽壓隨之增大，揮發(fā)性也隨之增加，這樣便增加了呈香呈味物質(zhì)在流體中的濃度，增加了萃取率。在這兩種相反的作用的影響下，在一定的萃取壓力下，萃取釜的升溫有可能促使萃取率的增加、降低或不變，萃取率的高低取決于這兩種影響哪種狀態(tài)占優(yōu)勢(shì)[8]。所以在35～45℃之間，隨著萃取釜萃取溫度的升高，溶質(zhì)的升高的揮發(fā)性的起著主要的作用，從而導(dǎo)致萃取率升高，但在萃取釜萃取溫度＞45℃以后，溶質(zhì)密度的下降起著主要的作用，從而降低呈香呈味物質(zhì)在二氧化碳流體中的溶解度，萃取率隨之降低。因此，萃取率隨分離釜萃取溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。故萃取釜萃取溫度為45℃時(shí)萃取率最大。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate

2.3 萃取壓力對(duì)萃取率影響

萃取釜的萃取壓力是超臨界CO2流體萃取過(guò)程的重要因素。二氧化碳處于超臨界狀態(tài)時(shí)的臨界壓力為7.52MPa，故試驗(yàn)的萃取釜的萃取壓力不能低于這個(gè)最小數(shù)值[9]。試驗(yàn)過(guò)程中控制試驗(yàn)的裝料系數(shù)為0.5，萃取釜的萃取溫度為45 ℃，CO2泵頻率為24 r/min，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，分離釜Ⅰ的溫度為45℃，分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ的溫度維持在35～36℃之間，不用專門(mén)調(diào)節(jié)。萃取壓力分別設(shè)為15 MPa，20 MPa，25 MPa，30 MPa，35 MPa。不同壓力對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取壓力對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction rate

由圖3可知，隨著萃取釜萃取壓力的增加，呈香呈味物質(zhì)的萃取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。隨著萃取釜萃取壓力的增加，二氧化碳的密度隨之增大，溶質(zhì)在二氧化碳中溶解度也隨之增大，提高了萃取率。但當(dāng)萃取釜的萃取壓力增大到一定數(shù)值時(shí)，流體的密度雖然增大，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致了二氧化碳流體的擴(kuò)散系數(shù)變小，不利于傳質(zhì)，影響萃取率。因此萃取率隨著萃取壓力的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。故萃取釜萃取壓力為30 MPa時(shí)，萃取率最大。

2.4 二氧化碳流量對(duì)萃取率影響

CO2泵頻率的變化會(huì)導(dǎo)致二氧化碳通過(guò)酒糟顆粒的流量發(fā)生變化，影響復(fù)雜的超臨界萃取過(guò)程。在一定的萃取條件下，超臨界CO2流體通過(guò)萃取釜的流量因流速或者萃取時(shí)間的關(guān)系，而不能充分與原材料接觸或許太過(guò)飽和而浪費(fèi)CO2。因此需要通過(guò)對(duì)CO2泵的頻率的調(diào)節(jié)，而使二氧化碳流體與溶質(zhì)充分接觸而不浪費(fèi)二氧化碳[10]。試驗(yàn)過(guò)程中控制試驗(yàn)的萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為45℃，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，分離釜Ⅰ溫度為40℃，裝料系數(shù)為0.5，分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ溫度維持在35～36℃之間，不用調(diào)節(jié)。CO2泵頻率分別設(shè)為20 r/min，22 r/min，24 r/min，26 r/min，28 r/min。不同泵頻率對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 CO2泵頻率對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of CO2pump frequency on extraction rate

由圖4可知，當(dāng)二氧化碳泵的頻率增大時(shí)，二氧化碳通過(guò)酒糟的流速加快，停留時(shí)間變短，導(dǎo)致二氧化碳流體與酒糟的接觸時(shí)間減少，這樣對(duì)萃取不利。但是隨著所設(shè)置的二氧化碳泵頻率的增加，通過(guò)酒糟的CO2流量便會(huì)增加，使二氧化碳流體可以方便的把被溶解的溶質(zhì)從酒糟的表面帶走，從而使萃取率提高。因此，萃取率隨CO2泵頻率的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。故CO2泵頻率為22 r/min時(shí)萃取率最大。

2.5 分離釜Ⅰ的溫度對(duì)萃取率影響

從超臨界萃取特點(diǎn)和原理得知，在萃取的時(shí)候控制一定的壓力和溫度，通過(guò)調(diào)節(jié)分離體系中的壓力和溫度，進(jìn)而改變?nèi)苜|(zhì)在超臨界流體中的溶解度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物質(zhì)的萃取和分離[11]。設(shè)置萃取的壓力為30 MPa，萃取的溫度為40℃，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，CO2泵頻率為22 r/min，裝料系數(shù)為0.5，分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ溫度維持在35～36℃之間，不用調(diào)節(jié)。分離釜Ⅰ的溫度分別設(shè)為35℃，40℃，45℃，50℃，55℃。分離釜Ⅰ的不同溫度對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 分離釜Ⅰ的溫度對(duì)溶質(zhì)萃取率的影響Fig.5 Effect of separation reactorⅠtemperature on extraction rate

由圖5可知，隨著分離釜Ⅰ溫度的增加，風(fēng)味組分的萃取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。一般提高分離釜的溫度可有效的提高萃取率。在分離釜的壓力不變的情況下，提高分離釜的溫度，分離釜內(nèi)體系的密度降低，隨之溶質(zhì)的溶解度也隨之降低，有利于溶質(zhì)分離。其次，隨著溫度升高使萃取物中的熱敏性物質(zhì)更加不穩(wěn)定，酒糟中的風(fēng)味組分隨著溫度升高，揮發(fā)性增強(qiáng)不利于分離。因此分離釜Ⅰ的溫度在45℃時(shí)，萃取率達(dá)到最大。

2.6 分離釜Ⅰ的壓力對(duì)萃取率影響

酒糟中含有一定量的有機(jī)酸。這些酸類有很強(qiáng)的刺激性，在CO2超臨界萃取過(guò)程中很容易被萃取出來(lái)。因此，需要將這部分物質(zhì)分離出去。這部分物質(zhì)的分子質(zhì)量相對(duì)比較小，極性不強(qiáng)，在CO2流體中，在比較低的壓力條件下仍具有較大的溶解度[12-13]。因此可以適當(dāng)降低CO2超臨界過(guò)程中分離釜Ⅰ的壓力，將需要的物質(zhì)分離出來(lái)，其中一些小分子量弱極性的物質(zhì)和有機(jī)酸等刺激性較大仍然可以繼續(xù)溶解在萃取溶劑中，從而達(dá)到了與萃取物分離的目的[12]。進(jìn)行分離釜Ⅰ壓力對(duì)萃取率的影響時(shí)控制試驗(yàn)的萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為40 ℃，CO2泵頻率為22 r/min，分離釜Ⅰ溫度為45℃，裝料系數(shù)為0.5，分離釜Ⅱ的壓力隨CO2鋼瓶?jī)?nèi)壓力的變化而變化，分離釜Ⅱ溫度維持在35～36℃之間，不用調(diào)節(jié)。分離釜Ⅰ的壓力分別設(shè)為6 MPa，7 MPa，8MPa，9MPa，10MPa。分離釜Ⅰ的不同壓力對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，風(fēng)味組分的萃取率在一定的壓力范圍隨著壓力增加而先增加后減少。在分離釜降低體系的壓力，同時(shí)體系的密度也隨之降低，導(dǎo)致溶解度降低，更容易使酒糟中的風(fēng)味物質(zhì)分離出來(lái)，從而有利于萃取率的提升。但是如果分離壓力太低，萃取的選擇性相對(duì)就差了。因此當(dāng)壓力為8 MPa時(shí)萃取率最大。

圖6 分離釜Ⅰ的壓力對(duì)溶質(zhì)萃取率的影響Fig.6 Effect of separation reactorⅠpressure on extraction rate

2.7 萃取時(shí)間的確定

超臨界二氧化碳流體的萃取過(guò)程大約可以分為三個(gè)步驟：萃取的起始階段、萃取的穩(wěn)定階段和萃取的最終階段。萃取的起始階段二氧化碳流體不能很好的與茅臺(tái)酒糟顆粒接觸，因此單位時(shí)間內(nèi)二氧化碳流體溶解的溶質(zhì)中的有效物質(zhì)就很少[14-15]。但是隨著超臨界二氧化碳流體的逐步滲入，超臨界CO2萃取進(jìn)入穩(wěn)定階段，二氧化碳流體可以與酒糟顆粒充分的接觸，傳質(zhì)可以達(dá)到最好的狀態(tài)，萃取率逐漸提高，最后到了超臨界萃取的最終階段，由于被萃取的酒糟中的溶質(zhì)含量逐漸減少?gòu)亩箚挝粫r(shí)間內(nèi)的萃取率減小直到最后降為零。因此也需要對(duì)超臨界萃取的時(shí)間也進(jìn)行確認(rèn)。不同萃取時(shí)間對(duì)萃取率影響的結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate

由圖7所示，分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ的萃取率隨著萃取時(shí)間的增長(zhǎng)，在0～150 min內(nèi)，超臨界萃取處于起始階段，萃取率相對(duì)較低；在150～210 min之間，萃取率呈現(xiàn)較大增長(zhǎng)趨勢(shì)，曲線斜率增大，處于超臨界萃取的穩(wěn)定階段，萃取量快速增多；但到萃取210 min以后，分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ萃取液的產(chǎn)量增加較小，曲線斜率越來(lái)越小，萃取過(guò)程處于最終階段，再萃取下去沒(méi)有實(shí)際意義，而且實(shí)際生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)效益不高。所以超臨界萃取的時(shí)間不應(yīng)該過(guò)長(zhǎng)，萃取時(shí)間應(yīng)選擇為210 min左右為最佳。

2.8 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

依據(jù)以上的單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定裝料系數(shù)為0.5，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa，確定了4因素（萃取壓力、萃取溫度、CO2泵頻率及分離釜Ⅰ溫度）3水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

從表3和表4的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果可知，以上各因素對(duì)萃取液萃取率的影響程度由大到小依次是是CO2泵的頻率（C）＞萃取溫度（B）＞分離釜Ⅰ的溫度（D）＞萃取壓力（A）。根據(jù)極差分析可知，以萃取率為考察指標(biāo)的最佳萃取工藝條件為C2B3D3A2，即超臨界二氧化碳流體萃取過(guò)程的萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為47℃，CO2泵頻率為21 r/min，分離釜Ⅰ的溫度為47℃。此條件下萃取率最高，可達(dá)到18.35%。

從所得的方差分析表中修正的模型的檢驗(yàn)，F(xiàn)值為5.47，P＜0.01，因此所用的模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。萃取溫度、萃取壓力、二氧化碳泵頻率和分離釜Ⅰ的溫度的P值都小于極顯著水平0.01，說(shuō)明萃取溫度、萃取壓力、二氧化碳泵頻率和分離釜Ⅰ的溫度對(duì)萃取率的影響都是極顯著的（P＜0.01）。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證了在裝料系數(shù)為0.5，萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為47℃，二氧化碳泵頻率為21 r/min，分離釜Ⅰ的溫度為47℃時(shí)，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa時(shí)的萃取條件下，萃取率最高，可達(dá)到18.35%

3 結(jié)論

以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)為基礎(chǔ)，獲得了超臨界二氧化碳萃取的最優(yōu)工藝條件，確定了在裝料系數(shù)為0.5，萃取釜壓力為30 MPa，萃取釜溫度為47℃，二氧化碳泵頻率為21 r/min，分離釜Ⅰ的溫度為47℃時(shí)，分離釜Ⅰ的壓力為8 MPa時(shí)的萃取條件下，萃取率最高，可達(dá)到18.35%