王玉榮，折米娜，劉康玲，張振東，雙 全*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053）

谷物發(fā)酵食品是以谷物為主要原料經(jīng)微生物代謝活動(dòng)以及酶與谷物各成分相互作用形成的一類(lèi)特色食品，通過(guò)發(fā)酵，谷物的營(yíng)養(yǎng)組分和產(chǎn)品特性可得到一定改善[1-2]。酸粥作為一種傳統(tǒng)的谷物發(fā)酵類(lèi)食品，在我國(guó)陜西、山西和內(nèi)蒙古等地區(qū)有著悠久的制作和食用歷史，其主要以糜米、小米和大米等谷物為原料經(jīng)自然發(fā)酵制作而成[3]。目前對(duì)酸粥的研究多集中于制作工藝探究和采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對(duì)其所含乳酸菌和酵母菌進(jìn)行分離鑒定，有關(guān)全面解析酸粥中真菌多樣性的研究尚少。薛建崗等[4]對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)酸粥樣品微生物組成進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該地區(qū)自然發(fā)酵酸粥細(xì)菌總數(shù)（7.67±1.23）lgCFU/mL、乳酸菌數(shù)（7.51±1.23）lgCFU/mL和酵母菌數(shù)（5.55±0.68）lgCFU/mL；李文亞等[5]對(duì)不同發(fā)酵時(shí)段的晉西北酸粥中酵母菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中；GOBBETTI M等[6]利用合成培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌和酵母菌進(jìn)行共同培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中酵母菌和乳酸菌存在共代謝關(guān)系；張春林[7]采用PCR-DGGE技術(shù)研究?jī)?nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸粥中微生物多樣性，結(jié)果表明乳桿菌、一些未培養(yǎng)菌以及酵母菌為樣品中主要的優(yōu)勢(shì)菌。

被稱為下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）的高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing），是從第一代測(cè)序技術(shù)發(fā)展而來(lái)的最新一代的測(cè)序方法，具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)、測(cè)序時(shí)間短以及數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，克服了基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學(xué)手段操作繁瑣、檢出率低等缺陷，能夠客觀全面地反應(yīng)微生物多樣性[8-11]。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于飲用水中微生物多樣性分析[12-13]、發(fā)酵食品微生物多樣性研究[14-15]以及環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)[16]等領(lǐng)域。然而，有關(guān)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)評(píng)價(jià)酸粥中真菌多樣性的研究少見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)微生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)酸粥樣品中真菌多樣性進(jìn)行研究，利用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行解析，以期為酸粥中微生物多樣性研究以及品質(zhì)改良提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸粥樣品：于2017年9月分別采集自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市、準(zhǔn)格爾旗和達(dá)拉特旗，依次編號(hào)為A1、A2、A3，采集的樣品置于加有冰盒的采樣箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）Top10：由民族特色食品研究室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑

氯化鈉、三氯甲烷、氫氧化鈉、Tris堿、濃鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraaceticacid-2Na，EDTA-2Na）、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）methylaminomethane，THAM）、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、醋酸鈉和乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5×TransStartTM、蛋白酶K（30 U/mg）、FastPfu Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、FastPfu Fly 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Polymerase（5 U/μL）、PMD18-T Vector、Solution I和2×TaqMaster Mix：寶生物工程（大連）有限公司；6×Loadingbuffer和DL2000DNAMarker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DNeasymericon Food Kit試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；引物SSU0817F/SSU1196R、NS1/NL4和M13F（-47）/M13R（-48）：均由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)NanoDrop公司；Veriti96孔梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DYY-12電泳儀：北京市六一儀器廠；FC2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；HR40-IIB2生物安全柜：海爾集團(tuán)電子商務(wù)有限公司；LRH-1000F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PowerLyzerR24強(qiáng)力珠磨式破碎儀：美國(guó)MOBIO公司；CT15RE離心機(jī)：株式會(huì)社日立制作所；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 酸粥樣品宏基因組的提取

參照QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒中的方法提取酸粥樣品的總DNA，使用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度，OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0之間的視為合格，將合格DNA置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 真菌18S rRNA V4-V5區(qū)PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

引物：采用文獻(xiàn)[17]中的引物對(duì)SSU0817F/SSU1196R。擴(kuò)增時(shí)在正向引物中加入7個(gè)核苷酸通用標(biāo)簽用于區(qū)分不同樣品：A1的標(biāo)簽為5'-TAGTGTG-3'，A2的標(biāo)簽為5'-TCGTCAT-3'，A3的標(biāo)簽為5'-TCATACA-3'。

PCR擴(kuò)增體系：4 μL 5×PCR Buffer，2 μL dNTP Mix（2.5mmol/L），0.8μLSSU0817F（5μmol/L），0.8μLSSU1196R（5 μmol/L），0.4 μL rTaq（5 U/μL），模板DNA 10 ng，用無(wú)菌超純水將體系補(bǔ)充至20 μL[18]。

PCR擴(kuò)增條件：參照曹?chē)?guó)君等[19]的方法調(diào)整為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

瓊脂糖凝膠電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（120 V，30 min），檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的條帶。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及定量

用PCR清潔試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并用無(wú)菌超純水將產(chǎn)物濃度稀釋至100 nmol/L后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

參照CAPORASO J G等[20-22]的方法利用QIIME平臺(tái)對(duì)序列進(jìn)行拼接、質(zhì)量控質(zhì)及序列劃分，建立分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units，OTU）；然后利用RDP[23]和Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)[24]對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析。

1.3.5 核酸登錄號(hào)

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，ID號(hào)為mgp84785

1.3.6 酵母菌的分離純化與鑒定

（1）酵母菌的分離純化

采用稀釋平板法將倍比稀釋后的樣液取10-1、10-2和10-3三個(gè)梯度涂布于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行菌株純化，并用30%的甘油將純種菌株凍存于-80℃超低溫保存箱中[25-26]。

（2）酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

DNA提?。翰捎貌Ａе槠扑榉▽?duì)純化菌株進(jìn)行DNA提取，每1 mL菌懸液中添加0.3 g直徑為0.5 mm的玻璃珠，組織破碎儀的運(yùn)行條件為每隔20s運(yùn)行60 s，循環(huán)5次，頻率為70 Hz[27]。

PCR擴(kuò)增：引物為NS1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。PCR擴(kuò)增體系為25μL，反應(yīng)程序?yàn)?4℃、4min；95℃、1min，50 ℃、45 s，72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min[28]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證、純化與克隆：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證、純化，然后與載體TMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中，將陽(yáng)性克隆送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：利用BioEdit7.1.3和DNAMAN7.0軟件對(duì)返回的序列進(jìn)行處理，并將去除引物的序列傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進(jìn)行同源性比對(duì)，應(yīng)用分離株和模式株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用α多樣性分析法對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用柱形圖和熱圖展示不同分類(lèi)水平下各門(mén)和屬的相對(duì)含量，熱圖由Matlab2010b軟件繪制；使用維恩（Venn）圖展示不同樣品中特有或共有的OTU數(shù)和序列數(shù)，Venn圖由Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線繪制；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)選用Mega7.0中的鄰近（neighbor-joining，NJ）法進(jìn)行1000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建；其他分析圖使用Origin8.5和SAS9.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

超1（Chao1）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)是衡量群落物種總數(shù)和多樣性的常用指數(shù)[29-30]。本研究首先依次在界、門(mén)、綱、目、科和屬分類(lèi)水平以及物種多樣性指數(shù)上統(tǒng)計(jì)各樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果如表1所示。

表1 3種酸粥樣品的測(cè)序結(jié)果及各分類(lèi)水平數(shù)量Table 1 Results of sequencing and numbers of different taxonomical levels about three kinds of acidic-gruel samples

由表1可知，3個(gè)酸粥樣品共檢測(cè)出98133條序列，平均每個(gè)樣品測(cè)得32 711條序列。采用兩步UCLUST法對(duì)其進(jìn)行劃分：根據(jù)100%相似度可得到15 521條序列，再經(jīng)97%相似度分析可將這些序列劃分到74個(gè)OTU中。值得注意的是，在測(cè)序深度為36 510條序列時(shí)，樣品A2和A3的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均比A1樣品大，說(shuō)明A2和A3樣品中真菌豐富度和多樣性要比A1樣品中的高。進(jìn)一步采用香農(nóng)指數(shù)曲線和稀疏曲線對(duì)樣本進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種酸粥樣品的稀疏曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Rarefaction curves(A)and Shannon index curves(B)of three kinds of acidic-gruel samples

由圖1可知，在一定序列條數(shù)范圍內(nèi)，物種數(shù)（A）和香農(nóng)指數(shù)（B）均隨序列數(shù)的增加而增加，測(cè)序深度達(dá)到27000條序列左右時(shí)，稀疏曲線仍有上升趨勢(shì)，而香農(nóng)指數(shù)曲線早已進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明平均每個(gè)樣品32 711條序列的測(cè)序深度合適，滿足后續(xù)分析要求。

2.2 基于各分類(lèi)地位酸粥中真菌相對(duì)含量分析

經(jīng)質(zhì)控合格后，3種酸粥樣品中測(cè)得的98 133條序列被鑒定為4個(gè)門(mén)、12個(gè)綱、11個(gè)目、14個(gè)科和18個(gè)屬，僅有0.26%的序列不能鑒定到屬水平。內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)酸粥樣品中鑒定的4個(gè)真菌門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）和球囊菌門(mén)（Glomeromycota），平均相對(duì)含量＞1.0%的真菌門(mén)和屬構(gòu)成如圖2所示。

由圖2（A）可知，酸粥樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的核心優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為Basidiomycota和Ascomycota，其中Basidiomycota的平均相對(duì)含量高達(dá)96.46%。由圖2（B）可知，在屬水平上，酸粥樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%真菌屬主要由隸屬于Ascomycota的假絲酵母屬（Candida）和耐堿酵母屬（Galactomyces）以及隸屬于Basidiomycota的毛孢子菌屬（Trichosporon）構(gòu)成，其平均相對(duì)含量分別為84.3%、11.86%和3.45%，由此可見(jiàn)，鄂爾多斯地區(qū)酸粥中的優(yōu)勢(shì)真菌主要為Candida、Galactomyces和Trichosporon。白梅等[31]研究結(jié)果與本研究相似，其采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段從內(nèi)蒙古地區(qū)28份酸粥樣品中分離純化出40株酵母菌，經(jīng)分子生物學(xué)手段鑒定后發(fā)現(xiàn)在樣品中出現(xiàn)頻次較高的菌屬及其頻率依次為伊薩酵母屬（Issatchenkia）75.00%、假絲酵母屬（Candida）17.85%和毛孢子菌屬（Trichosporon）10.71%。未分離出Galactomyces的菌株，這可能與制作酸粥的方法、原料以及菌株的特殊生長(zhǎng)需求等因素有關(guān)。

圖2 3種酸粥樣品中核心門(mén)（A）和屬（B）的相對(duì)含量Fig.2 Relative contents of the core phylum(A)and genus(B)in three kinds of acidic-gruel samples

在對(duì)97%的相似度下劃分的74個(gè)OTU分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，OTU68、OTU71、OTU43、OTU42、OTU2、OTU44、OTU61 和OTU73是本研究分析的酸粥樣品中共有的操作分類(lèi)單元，即核心OTU，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，這8個(gè)OTU無(wú)明顯的聚類(lèi)趨勢(shì)，經(jīng)Green genes和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，這些OTU依次被鑒定為未分類(lèi)子囊菌綱（unclassified Sordariomycetes）、青霉屬（Penicillium）、枝孢菌屬（Cladosporium）、絲孢菌屬（Tetracladium）、假絲酵母屬（Candida）、假絲酵母屬（Candida）、毛孢子菌屬（Trichosporon）和未分類(lèi)銀耳綱（unclassified Tremellomycetes）。Candida在3種酸粥樣品中的平均相對(duì)含量明顯比其他屬高，這與圖2分析結(jié)果一致。

圖3 3種酸粥樣品中核心OTU相對(duì)含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis on relative contents of core OTU in three kinds of acidic-gruel samples

OTU在3種酸粥樣品中的出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。

圖4 OTU在3種酸粥樣品中出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)Fig.4 Occurrence frequency statistics of OTU in 3 kinds of acidic-gruel samples

由圖4可知，74個(gè)操作分類(lèi)單元中僅出現(xiàn)一次的OTU有45個(gè)，占OTU總數(shù)的比例為60.81%，其包含序列數(shù)為897條；出現(xiàn)兩次的OTU有21個(gè)，占OTU總數(shù)的28.38%，包含12 013條序列；出現(xiàn)三次的OTU僅有8個(gè)，占OTU總數(shù)的10.81%，包含85 223條序列。說(shuō)明鄂爾多斯地區(qū)酸粥樣品中存在著大量共有真菌菌群，同時(shí)各樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)也存在較大差異。

采用Venn圖對(duì)各樣本中所含OTU及序列數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，3種酸粥樣品A1、A2和A3各自特有的OTU數(shù)分別為5、12和28個(gè)，其所包含的序列數(shù)及占總序列數(shù)的比例分別為5條（0.0051%）、720條（0.73%）和172條（0.18%）；A1和A2共有的OTU數(shù)為1個(gè)，序列數(shù)為634條，占總序列數(shù)的0.65%；A2和A3共有的OTU數(shù)為14個(gè)，序總列數(shù)為11 184條，占總序列數(shù)11.40%；A1和A3共有的OTU數(shù)為6個(gè)，序列數(shù)為195條，占總序列數(shù)的0.20%；A1、A2和A3共有的OTU數(shù)為8個(gè)，序列數(shù)為85223條，占總序列數(shù)的86.84%。由這些數(shù)據(jù)可直觀的看出，各個(gè)樣品都有自己獨(dú)特的真菌菌落，但彼此間又有共有微生物，雖然3種酸粥樣品共有的OTU較少，但其所含序列占總序列數(shù)的比例卻極高，說(shuō)明酸粥中核心真菌種類(lèi)較多且基本一致。

圖5 3種酸粥樣品基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram of three kinds of acidic-gruel samples based on OUT level

2.3 酸粥中酵母菌的分離及分子生物學(xué)鑒定

采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段從3種酸粥樣品中共分離純化出9株酵母菌，編號(hào)分別為JA1-1、JA1-2、JA1-3、JA2-1、JA2-2、JA2-3、JA2-4、JA3-1和JA3-2，對(duì)其28S rRNA序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 基于28S rRNA序列分析的酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenic tree of yeasts based on 28S rRNA sequence analysis

由圖6可知，各菌株與其近源種間的自展值均為100，說(shuō)明二者親緣關(guān)系可靠，故判定菌株JA1-1和JA1-3為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis），菌株JA3-2為茶葉籽酵母（Meyerozyma caribbica），菌株JA1-2為索拉尼假絲酵母（Candida solani），菌株JA2-2和JA3-1為庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），菌株JA2-1為白地霉（Galactomycescandidum），菌株JA2-4為解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），菌株JA2-3為隱球酵母（Cryptococcus albidus）。分離出的菌株中有2株隸屬于Candida，1株隸屬于Galactomyces，但未分離出Miseq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出的隸屬于Trichosporon的菌株，這可能與該菌屬特殊生長(zhǎng)需求以及本研究所采用的培養(yǎng)方式和條件有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用高通測(cè)序技術(shù)研究鄂爾多斯地區(qū)酸粥中真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)3種酸粥樣品中核心優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）和子囊菌門(mén)（Ascomycota），優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為假絲酵母屬（Candida）、耐堿酵母屬（Galactomyces）和毛孢子菌屬（Trichosporon），其平均相對(duì)含量分別為84.3%、11.86%、3.45%；在對(duì)各樣品共有或特有的OTU進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)各個(gè)樣品都有自己獨(dú)特的真菌菌落，但彼此間又有共有微生物，這些核心真菌種類(lèi)較多且基本一致。采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法從3種酸粥樣品中共分離出9株酵母菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，近平滑假絲酵母（C.parapsilosis）2株，茶葉籽酵母（M.caribbica）、索拉尼假絲酵母（C.solani）、庫(kù)德畢赤酵母（P.kudriavzevii）、為白地霉（G.candidum）、解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）和隱球酵母（C.albidus）各1株。為酸粥中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究以及發(fā)酵劑的研發(fā)提供一定參考。