陶宏衛(wèi)， 郭廣富， 曹軍平， 申建榮， 張晉川， 練國(guó)俊， 朱愛(ài)萍， 張佳浩， 朱金其

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.江蘇泰州泰牧動(dòng)物醫(yī)院，江蘇泰州 225300；3.江蘇濱海鴻盛生豬飼養(yǎng)有限公司，江蘇濱海 224500)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovims)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一。根據(jù)致病性、抗原性以及核酸序列的不同，將PCV分為PCV1和PCV2這2個(gè)血清型。PCV2感染豬群能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合癥(porcine respiratory disease complex，PRDC)及懷孕母豬繁殖障礙(sow abortion and mortality syndrome，SAMS)等[1]。血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查證實(shí)，PCV2呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。PCV2基因組大小約1.7 kp，包括5個(gè)基因亞型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e[4]。

本研究通過(guò)鹽城地區(qū)疑似發(fā)生PMWS的2個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)采集病料，PCR擴(kuò)增PCV2全基因組，并進(jìn)行序列測(cè)定和比較分析，旨在了解PCV2的遺傳變異情況，為今后的深入研究和科學(xué)防控該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥豬的腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織，于2015年11月采自鹽城地區(qū)2個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的2份病料?；蚪MDNA快速抽提試劑盒(動(dòng)物)、TaqDNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、2 000 bp DNA Ladder、pUCm-T載體及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，6×DNA凝膠載入染料(Loading Dye)、內(nèi)切酶PstⅠ等購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，合成1對(duì)可擴(kuò)增PCV2全基因組的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：P1：5′-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3′；P2：5′-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。

1.3 病料中PCV2全基因組的PCR擴(kuò)增

將采集的病豬脾臟、淋巴結(jié)和肺等組織混合，研磨研碎，按1 ∶5加入無(wú)菌含雙抗的PBS溶液，混勻，-20 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃ 8 000 r/min離心7 min，取上清，用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說(shuō)明書(shū)上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用 50 μL 反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer、TaqDNA聚合酶1 μL、模板DNA 3 μL、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 pmol/L 的上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果并回收膠。

1.4 PCV2全基因組測(cè)序

將膠回收的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取經(jīng)PCR初步鑒定為陽(yáng)性的白斑菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行重組質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 PCV2基因序列的比較分析

應(yīng)用DNA Star和MEGA 5.2分析軟件對(duì)擴(kuò)增的PCV2全基因組和GenBank中的8株P(guān)CV2基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。用于本研究分析的參考毒株基因組序列均來(lái)自于NCBI(表1)。

表1 各分離株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病料中PCV2全基因組的PCR擴(kuò)增

以組織病料提取的DNA為模板，用P1和P2引物擴(kuò)增PCV2全基因組，由圖1可知，2份病料均呈陽(yáng)性，其PCR擴(kuò)增片段大小約1.7 kb，與預(yù)期的結(jié)果相符。將2個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)到的PCV2分別命名為BH07株、BH11株。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將膠回收的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，獲得重組質(zhì)粒。PCR鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果為陽(yáng)性(圖2)；使用內(nèi)切酶PstⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果呈陽(yáng)性(圖3)。

2.3 PCV2全基因核苷酸同源性比較

將鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序發(fā)現(xiàn)BH07株和BH11株全長(zhǎng)分別為1 767、1 766 bp。從NCBI上收錄的毒株序列中選取8株P(guān)CV2基因序列，包含PCV2的5種基因亞型(PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e)的代表毒株和PCV1的代表株。運(yùn)用DNA Star軟件對(duì)其進(jìn)行同源性分析，由表2可知，BH07株和BH11株與不同亞型的分離株同源性均較高，最高為99.0%，最低為73.3%，其中BH07株與PCV2d代表株AY181946的核苷酸同源性最高，為97.6%；BH11株與AY181946的核苷酸同源性最高，為97.8%；BH07株與BH11株的核苷酸同源性為98.1%。

表2 PCV2全基因核苷酸同源性比較

注：毒株各編號(hào)分別代表以下毒株：1為EU148503，2為EU148505，3為GU371908，4為BH11，5為BH07，6為AF055392，7為AF055394，8為AY181946，9為AY660574，10為EF524532。

2.4 PCV2全基因遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用軟件MEGA 5.2中的鄰近歸并法繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)重復(fù)參考值設(shè)定為1 000次重復(fù)。從繪制的進(jìn)化樹(shù)(圖4)中可見(jiàn)，PCV分成2個(gè)完全獨(dú)立的大分支，其中8株P(guān)CV2構(gòu)成1個(gè)大的分支，其他2株P(guān)CV1則組成另一獨(dú)立的大分支。本研究獲得的BH07株和BH11株屬于8株P(guān)CV2中的組成部分，且與PCV2d代表株AY181946共同構(gòu)成1個(gè)獨(dú)立的小分支。由此可知，BH07株和BH11株P(guān)CV2均屬于PCV2d基因亞型。

3 討論

歐盟根據(jù)PCV2全基因組在進(jìn)化樹(shù)上遺傳距離大小的不同將其分成PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e等5個(gè)基因亞型，其中PCV2e和PCV2a均屬于傳統(tǒng)分類(lèi)方法中的PCV2a，PCV2c、PCV2d和PCV2b均屬于傳統(tǒng)分類(lèi)方法中的PCV2b。Wang等對(duì)中國(guó)多個(gè)省份病料中的PCV2進(jìn)行了分離鑒定及亞型區(qū)分，首次報(bào)道了PCV2d亞型在中國(guó)存在[6]。本次試驗(yàn)的2個(gè)毒株經(jīng)過(guò)核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化樹(shù)的分析驗(yàn)證，最終確定BH07株和BH11株P(guān)CV2均屬于PCV2d基因亞型。PCV2基因組全長(zhǎng)為1 766～1 768 bp，本次測(cè)序結(jié)果BH07株和BH11株全長(zhǎng)不一致，分別為1 767、1 766 bp，比較二者基因序列發(fā)現(xiàn)BH11株在824位缺失了1個(gè)堿基。這與曹東陽(yáng)等報(bào)道的江蘇鹽城地區(qū)存在基因大小1 766 bp的PCV2d[7]是一致的。本試驗(yàn)對(duì)鹽城地區(qū)2個(gè)豬圓環(huán)病毒病豬場(chǎng)的病料進(jìn)行了PCV2全基因組克隆與序列分析，為今后進(jìn)一步深入研究該病毒的生物學(xué)特性及開(kāi)發(fā)有效的免疫制劑提供了科學(xué)的參考依據(jù)。