肖偉敏，劉文麗，張協(xié)光，蘇佳婷，楊國武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518109)

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸組成的化合物，參與核酸構(gòu)成，對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育有重要的營養(yǎng)作用，其在母乳中含量豐富，但在牛乳中的含量較低[1-2]，因此，核苷酸作為重要的營養(yǎng)強(qiáng)化劑被廣泛用于嬰幼兒食品和乳品中。在我國，根據(jù)《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB14880-2012的規(guī)定，嬰幼兒配方食品中作為添加劑的核苷酸主要有胞嘧啶核苷酸(CMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)、次黃嘌呤核苷酸(IMP)，添加量為0.12～0.58 g/kg(以核苷酸總量計(jì))[3]。

嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的常見檢測(cè)方法有反相高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[4-12]，其中高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。我國于2016年8月31日頒布了高效液相色譜測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的方法標(biāo)準(zhǔn)——《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》GB 5413.40-2016(以下簡(jiǎn)稱GB 5413.40)[13]?！秶沂称钒踩O(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則(2017年版)》規(guī)定，2017年3月1日起核苷酸在我國開始作為嬰幼兒配方食品的抽檢項(xiàng)目。但實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，以GB 5413.40“5.2參考色譜條件”測(cè)定時(shí)，由于核苷酸物質(zhì)的極性較大，用C18-T反相色譜柱分析時(shí)，流動(dòng)相中即使加入離子對(duì)試劑四丁基硫酸氫銨，CMP在反相色譜柱上的保留依然較弱，出峰時(shí)間早，以致對(duì)實(shí)際樣品中的CMP進(jìn)行定量時(shí)有基質(zhì)干擾(見圖1)，從而給監(jiān)督檢驗(yàn)工作帶來了困難。

勵(lì)炯等[8]以固相萃取凈化，使用氨基柱測(cè)定核苷酸；鄭紅等[5]使用強(qiáng)陰離子固相萃取柱凈化樣品，再用反相色譜柱分離核苷酸。兩種方法均對(duì)GB 5413.40的樣品前處理和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。但在依據(jù)GB 5413.40開展監(jiān)督檢驗(yàn)時(shí)，樣品前處理?xiàng)l件須按國標(biāo)指定的要求，僅標(biāo)準(zhǔn)中的“參考色譜條件”允許優(yōu)化。因此，為依據(jù)GB 5413.40準(zhǔn)確開展嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的監(jiān)督檢驗(yàn)工作，本研究結(jié)合核苷酸在陰離子交換方面的保留和分離優(yōu)勢(shì)，首次將陰離子交換色譜柱應(yīng)用于嬰幼兒食品和乳品中5種核苷酸的測(cè)定，建立了準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的陰離子交換高效液相色譜測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量的方法，可為嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的含量檢測(cè)及國家產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)，配二極管陣列檢測(cè)器；分析天平(感量為0.1 mg)。

核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP購自百靈威公司，GMP、IMP購自安譜公司，標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%；磷酸二氫鉀(分析純)、甲醇(色譜純)直接使用；奶粉質(zhì)控樣品SRM1849a(簡(jiǎn)稱1849a)購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)；嬰幼兒配方食品來源于深圳市各大市場(chǎng)和超市。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水(美國Millipore公司Milli-Q超純水機(jī)制備)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用水配制質(zhì)量濃度均為1.00 g/L的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。然后配制5種核苷酸質(zhì)量濃度分別為0.200、1.00、10.0、50.0、100、200 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于線性關(guān)系考察。

1.3 樣品前處理

樣品前處理按GB 5413.40中的“5.1試樣制備”進(jìn)行。

1.3.1樣品預(yù)處理含淀粉的試樣：稱取混合均勻的固體試樣5 g(精確至0.1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入約0.2 g淀粉酶，用20 mL熱水(30～40 ℃)充分溶解，或稱取混合均勻的液體試樣約20 g(精確至1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入約0.2 g淀粉酶搖勻，于(37±2) ℃培養(yǎng)箱內(nèi)酶解30 min。取出冷卻至室溫。

不含淀粉的試樣：取混合均勻的固體試樣5 g(精確至0.1 mg)于100 mL錐形瓶中，加入20 mL熱水(50～60 ℃)充分溶解，冷卻至室溫，或稱取混合均勻的液體試樣約20 g(精確至1 mg)于100 mL錐形瓶中。

1.3.2待測(cè)液的制備用醋酸將試樣溶液調(diào)至pH 4.1，移入50 mL容量瓶中，用水定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45 μm微膜過濾，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)強(qiáng)陰離子交換色譜柱，流動(dòng)相：A為甲醇、B為磷酸二氫鉀水溶液(10 mmol/L，pH 4.5)；梯度洗脫：0～25.0 min，40%～100%B；25.0～25.1 min，100%～40%B；流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

圖1 采用C18-T色譜柱分離核苷酸的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of nucleotides by C18-T column A：mixed standard solution；B：real sample

圖2 采用SAX色譜柱分離核苷酸的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of nucleotides by SAX columnA：mixed standard solution；B：real sample；separation condition：“1.4”

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

考察了GB 5413.40推薦的C18-T色譜柱(SupelcosilTMLC-18-T，250 mm×4.6 mm，5 μm),以及Phenomenex Kinetex PFP(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)等其它類型的色譜柱對(duì)核苷酸的分離效果。結(jié)果表明，C18-T和SAX色譜柱對(duì)5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的分離較好。但在實(shí)際樣品分析時(shí)，由于CMP在C18-T反相色譜柱上的保留較弱，出峰較早，定量時(shí)有基質(zhì)干擾(見圖1)。因此，本研究最終采用SAX色譜柱進(jìn)行分離分析。

盡管離子色譜法是分析陰、陽離子的高效分離測(cè)試技術(shù)[14]，且核苷酸在水溶液中呈離子狀態(tài)，可應(yīng)用離子色譜的作用原理進(jìn)行分離。但實(shí)際工作中離子色譜儀的應(yīng)用不如高效液相色譜儀廣泛，故本文選用離子色譜原理進(jìn)行分離的離子交換色譜柱。Zorbax SAX色譜柱因硅膠上鍵合了季銨強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，故具有離子交換作用和反相吸附作用。本研究結(jié)果表明，陰離子交換高效液相色譜法分離核苷酸時(shí)，各待測(cè)物在實(shí)驗(yàn)條件下均有較好的保留，可實(shí)現(xiàn)基線分離，且標(biāo)液和樣品檢測(cè)時(shí)5種核苷酸均無干擾，定量準(zhǔn)確(見圖2)。

2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

離子交換色譜的流動(dòng)相需要合適的緩沖溶液，本實(shí)驗(yàn)選擇離子交換色譜法的常用淋洗劑——KH2PO4水溶液作為流動(dòng)相。由于核苷酸在強(qiáng)酸性及堿性條件下不穩(wěn)定，在pH值較低的強(qiáng)酸性條件下，核苷酸的解離被抑制；而pH值升高至弱酸性條件時(shí)，核苷酸解離為陰離子，與SAX固定相作用力增強(qiáng)，保留增加。通過對(duì)pH值(pH 3.0、4.5)的優(yōu)化比較，選擇分離和峰形較好的10 mmol/L KH2PO4(pH 4.5)水溶液作為緩沖溶液。

在離子交換色譜中存在3種電離平衡，分別為樣品組分的電離平衡、流動(dòng)相中緩沖溶液的電離平衡、柱上離子交換基團(tuán)的電離平衡。色譜柱保留行為的變化、流動(dòng)相組成會(huì)綜合影響上述電離平衡[15]。因此，在流動(dòng)相條件優(yōu)化時(shí)，設(shè)計(jì)了緩沖液梯度增加(見“1.4”)和緩沖液梯度減少(0～23.0 min，100%～35%B；23.0～23.1 min，35%～100%B)兩種方式，流速均為1 mL/min。實(shí)驗(yàn)表明，兩種梯度變化方式下，5種核苷酸均可實(shí)現(xiàn)基線分離。在不同的洗脫條件下，各組分之間的出峰順序和分離度發(fā)生了改變，實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)各分析物進(jìn)行定性。由于緩沖液梯度增加(見“1.4”)方式的分離度更好，保留時(shí)間更穩(wěn)定，色譜柱的使用壽命更長(zhǎng)，因此確定為色譜條件。

2.3 線性范圍、檢出限與定量下限

將核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按優(yōu)化條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，mg/L)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)做線性回歸方程；分別以信噪比(S/N)為3和10計(jì)算檢出限和定量下限，結(jié)果見表1。5種核苷酸的線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8～1.000 0，線性范圍均為0.200～200 mg/L。而且，本改良方法較GB 5413.40的定量下限(CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的定量下限分別為3.3、5.0、5.0、5.0、6.7 mg/kg)更低。

表1 5種核苷酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of five nucleotides

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白嬰幼兒配方奶粉5 g，分別添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣品，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。結(jié)果表明，本方法的回收率為95.5%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～3.2%，準(zhǔn)確度和精密度符合GB/T 27404-2008 F.1和F.3的要求[16]。

表2 5種核苷酸的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of five nucleotides spiked in samples(n=6)

2.5 實(shí)際樣品分析

本研究在2017年完成了深圳市100多批次嬰幼兒配方食品中核苷酸的測(cè)定，包含雅培、美贊臣、美素佳兒、惠氏、愛他美、諾貝能、太子樂、合生元等品牌。同時(shí)，測(cè)定了有證質(zhì)控樣品1849a。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1849a質(zhì)控樣品中的5種核苷酸含量均在參考值范圍內(nèi)，實(shí)際奶粉樣品的檢測(cè)均無基質(zhì)干擾，部分樣品的檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 1849a質(zhì)控奶粉和10個(gè)嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的含量

Table 3 Contents of nucleotides in 1849a quality control milk powder and 10 infant formula milk powder (mg/100g)

*no detected

3 結(jié) 論

本研究建立了陰離子交換高效液相色譜測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量的方法。該方法樣品前處理依據(jù)GB 5413.40，處理過程簡(jiǎn)單；在高效液相色譜分離階段，陰離子交換色譜柱對(duì)核苷酸類物質(zhì)有較強(qiáng)的保留，5種核苷酸分離度好，檢出限低，定量準(zhǔn)確度高。該改良方法很好地解決了高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中核苷酸含量時(shí)易被雜質(zhì)干擾的問題，完善了GB 5413.40的參考色譜條件，可為嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的監(jiān)督監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。