王云龍，劉松*，堵國成，陳堅(jiān)

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

L-天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1，L-Asparaginase，L-ASNase)是一種酰胺基水解酶，可以將天冬酰胺脫氨基生成天冬氨酸和氨[1]。該酶具有抗腫瘤活性，已被用于治療淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤及霍金森病等疾病[2]。最新報(bào)道顯示，該酶也可用于油炸食品中以減少丙烯酰胺的生成[3-4]。由于L-ASNase在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域中的重要應(yīng)用，已引起國內(nèi)外廣大學(xué)者的極大興趣。

L-ASNase廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中[5]。但是由于動(dòng)植物中L-ASNase含量少，分離提取困難，而微生物發(fā)酵法具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、提取純化簡(jiǎn)便以及易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為商品化L-ASNase的主要來源[6]。由于野生菌發(fā)酵L-ASNase產(chǎn)量往往較低[7-8]，應(yīng)用重組菌發(fā)酵成為提高L-ASNase產(chǎn)量的重要途徑[9-11]。KHUSHOO[12]等通過控制重組菌E.coliBLR(DE3)比生長速率并優(yōu)化誘導(dǎo)劑添加時(shí)間，L-ASNase酶活在2 L發(fā)酵罐水平達(dá)到870 U/mL，其搖瓶水平L-ASNase產(chǎn)量為30.67 U/mL。龍水清[13]通過補(bǔ)料和溶氧控制策略將B.subtilis168L-ASNase的最終產(chǎn)量在5 L發(fā)酵罐水平提高到112.61 U/mL。SUSHMA[14]等通過培養(yǎng)基優(yōu)化和持續(xù)誘導(dǎo)策略使B.subtilisWB800NL-ASNase產(chǎn)量在3 L發(fā)酵罐水平達(dá)到525.98 U/mL，其搖瓶水平為381.4 U/mL。

培養(yǎng)基是重組菌株生長和產(chǎn)物合成的基礎(chǔ)，優(yōu)化培養(yǎng)基組成對(duì)重組L-ASNase生產(chǎn)具有重要意義。目前，一系列試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和算法應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化。KRISHNAN等[15]通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)乳酸培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化率提高了30%。LI等[16]通過響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基使吩嗪-1-羧酸產(chǎn)量提高3倍。WU等[17]通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)-遺傳算法模型使核黃素的產(chǎn)量提高了76.4%。其中，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是模仿人腦處理情報(bào)方式的100%黑箱性質(zhì)的模型，對(duì)于高度非線性且含有噪聲的生物系統(tǒng)非常適用[18]。

本研究以研究室前期構(gòu)建的菌株Bacillussubtilis/ASNΔ25/B2為生產(chǎn)菌株[11]，通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、中心組合實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)B.subtilis/ASNΔ25/B2產(chǎn)L-ASNase發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以充分發(fā)揮菌株生產(chǎn)性能，提高L-ASNase產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：B.subtilis/ASNΔ25/B2[11]，由江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室構(gòu)建并保藏。

試劑：酵母粉，胰蛋白胨,英國Oxoid公司，BR;安琪酵母蛋白胨FP103，安琪胰蛋白胨FP318,安琪酵母股份有限公司，BR，安琪胰蛋白胨FP319,安琪酵母股份有限公司，BR;思賓格酵母蛋白胨，思賓格0805酵母浸粉，思賓格0806酵母浸粉,廣州一品鮮生物科技有限公司;L-天冬酰胺,美國Sigma-Aldrich公司；其他常用試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純。

卡那平板培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂20，硫酸卡那霉素0.05。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，硫酸卡那霉素0.05。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖35，胰蛋白胨20，尿素0.8，玉米漿8，K2HPO4·3H2O 3.26，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 1.8，NaCl 3，L-天冬酰胺1.2。初始pH 7.5。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖65，酵母蛋白胨28，玉米漿11，KH2PO411.5，NaCl 3.3，(NH4)2SO44，K2HPO4·3H2O 22.5，MgSO4·7H2O 1，L-天冬酰胺2。初始pH 7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

XWY-240恒溫?fù)u床,上海智誠儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī),德國eppendorf公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì),日本Shimadzu公司；pH計(jì),瑞士Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 種子活化

取適量保存在冷凍甘油管中的菌液涂布至卡那平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將活化好的種子接種至裝有60 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，添加60 μL的50 mg/mL硫酸卡那霉素，搖床溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)8～10 h。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按4%的接種量將種子培養(yǎng)基接入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上使用Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析[19]，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的9種成分進(jìn)行研究。每個(gè)因素取高(+1)、低(-1)兩個(gè)水平，2個(gè)虛擬變量用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，以酶活為響應(yīng)值。各組分及其水平設(shè)置如表1所示。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中變量的真實(shí)值Table 1 Real values of variables in Plackett-Burman experimental design

1.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮各因素效應(yīng)正負(fù)和原料成本來確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中各因素水平。

1.4.3 中心組合實(shí)驗(yàn)

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件為水平中心，使用Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行5因素5水平的中心組合實(shí)驗(yàn)(簡(jiǎn)稱CCD實(shí)驗(yàn))[19]，如表2所示。

表2 CCD實(shí)驗(yàn)中的變量和水平Table 2 Variable and its level in CCD design

1.4.4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

使用JMP10.0以CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為訓(xùn)練和驗(yàn)證數(shù)據(jù)樣本，選擇“K重”交叉驗(yàn)證的方法執(zhí)行模型啟動(dòng)。設(shè)置合適的折數(shù)和隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)，過擬合罰項(xiàng)0.001，歷程數(shù)20，最大迭代數(shù)50，收斂準(zhǔn)則0.000 01。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度的測(cè)定

采用濁度法測(cè)定。取適量發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后使用紫外分光光度計(jì)于波長600 nm下測(cè)定吸光度，即OD600值。

1.5.2L-ASNase粗酶液制備

取一定量的發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，上清液即為L-ASNase粗酶液。

1.5.3L-ASNase酶活測(cè)定

采用奈氏試劑法[11]。取900 μL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH 7.5)加入200 μL底物(L-天冬酰胺，0.15 mol/L)于37 ℃保溫10～20 min后，加入100 μL稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的L-ASNase粗酶液，37 ℃反應(yīng)10 min后加入100 μL終止劑(三氯乙酸，1.5 mol/L)終止反應(yīng)，對(duì)照組在保溫前即加入終止劑。反應(yīng)結(jié)束后于12 000 r/min離心2 min，取100 μL上清，加入3 400 μL去離子水和500 μL奈氏試劑，混勻后在波長436 nm下測(cè)定吸光度。

酶活力單位定義：37 ℃每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol氨所需要的酶量定義為1個(gè)L-ASNase活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)L-ASNase酶活的影響

賈明媚[20]、陳璇[21]、SUSHMA[14]研究結(jié)果表明，蔗糖是B.subtilis合成L-ASNase的最適碳源。碳源濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶有較大的影響[21]。對(duì)初始培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，菌體量和L-ASNase產(chǎn)量持續(xù)提高。在蔗糖50 g/L時(shí)，L-ASNase產(chǎn)量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加蔗糖質(zhì)量濃度雖然有利于菌體生長，但不利于產(chǎn)酶。

圖1 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)L-ASNase酶活的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on L-ASNase activity

2.1.2 氮源對(duì)L-ASNase酶活的影響

在優(yōu)化了蔗糖質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上，添加相同質(zhì)量的不同有機(jī)氮源替換初始培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，結(jié)果如圖2所示。思賓格酵母蛋白胨和胰蛋白胨效果較好且接近，而酵母蛋白胨價(jià)格要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胰蛋白胨，故選擇酵母蛋白胨做進(jìn)一步研究。酵母蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)L-ASNase酶活的影響如圖2-B所示，隨著酵母蛋白胨濃度的增加，菌體量和酶活一直在增加。

圖2 有機(jī)氮源對(duì)L-ASNase酶活的影響Fig.2 Effect of organic nitrogen on L-ASNase activity

圖3 無機(jī)氮源對(duì)L-ASNase酶活的影響Fig.3 Effects of inorganic nitrogen sources on L-ASNase activity

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)是一種從多個(gè)因素中篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素的實(shí)驗(yàn)方法[19]，可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)使因素的主效果得到盡可能精確估計(jì)。在單因素實(shí)驗(yàn)確定的因素水平的基礎(chǔ)上，按照表1對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中9種組分進(jìn)行考察，以篩選出對(duì)酶活影響顯著的因素作進(jìn)一步優(yōu)化。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析如表3和表4所示。

表3 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及對(duì)應(yīng)的L-ASNase酶活Table 3 Placket-Burman experimental design and corresponding L-ASNase activity

表4 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)中各因素的影響Table 4 Effects of variables in the Placket-Burman experiment

注：R2=0.966 2，校正系數(shù)=0.907 0。

由表4中效應(yīng)或預(yù)測(cè)系數(shù)可知，9種成分中蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、MgSO4·7H2O對(duì)酶活表現(xiàn)為正效應(yīng)，其他因素表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。由p值可知，蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl對(duì)酶活的影響顯著(p值<0.05)，其他4種因素對(duì)酶活影響不顯著(p值>0.05)。對(duì)酶活影響不顯著的因素(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O和L-天冬酰胺效應(yīng)均為負(fù)，接下來的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度均取Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的低水平，即質(zhì)量濃度分別設(shè)為：4、22.5、2 g/L，MgSO4·7H2O效應(yīng)為正，取高水平，即質(zhì)量濃度設(shè)為1 g/L。下一步將對(duì)上述5種顯著因素的質(zhì)量濃度水平進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)對(duì)蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl等5種對(duì)酶活影響顯著的因素進(jìn)行優(yōu)化，以確定各因素進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)的水平中心。綜合考慮正負(fù)效應(yīng)和原料成本，確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)各因素的水平，如表5所示。由表5可知，第4組實(shí)驗(yàn)獲得的酶活最大，故以該培養(yǎng)基組成為CCD實(shí)驗(yàn)的水平中心。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experiment design of path of steepest ascent and the corresponding results

2.4 CCD實(shí)驗(yàn)

按照表2采用CCD實(shí)驗(yàn)來確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化需要輸入的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示。

表6 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 CCD experimental design and results

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

“K重”交叉驗(yàn)證的方法可以將建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型很好的推廣到新數(shù)據(jù)，故選擇“K重”交叉驗(yàn)證的方法對(duì)CCD實(shí)驗(yàn)建立的數(shù)據(jù)樣本執(zhí)行模型啟動(dòng)。建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型時(shí)，隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)是需要指定的重要數(shù)值。如果將此值設(shè)定得過低，則會(huì)擬合不足；而如果過高，則會(huì)過度擬合[22-23]。在經(jīng)過大量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后，確定折數(shù)為5，隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)為7，采用5×7×1的3層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如圖4所示。即5個(gè)輸入神經(jīng)元，分別代表蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl；7個(gè)隱含層神經(jīng)元；1個(gè)輸出神經(jīng)元，代表酶活。設(shè)置折數(shù)5，隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)為7，過擬合罰項(xiàng)0.001，歷程數(shù)20，最大迭代數(shù)50，收斂準(zhǔn)則0.000 01，執(zhí)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合迭代過程。訓(xùn)練擬合決定系數(shù)R2為0.978 5(圖5-A)，驗(yàn)證擬合決定系數(shù)R2為0.995 1(圖5-B)，說明該5×7×1的3層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能很好地對(duì)數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行擬合。

圖4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Structure of artificial neural network

圖5 酶活預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)性Fig.5 The correlation of actual values and the predicted values

2.6 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化結(jié)果分析

為了考察5種顯著成分對(duì)L-ASNase酶活的影響，利用JMP10.0中的刻畫器功能進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)刻畫圖Fig.6 Prediction plot of the neural network

由圖6可知，蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活有較大的影響。隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，酶活逐漸增加，在蔗糖質(zhì)量濃度為65 g/L時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加蔗糖質(zhì)量濃度，酶活反而下降。這可能是因?yàn)檫^高的蔗糖質(zhì)量濃度會(huì)導(dǎo)致有機(jī)酸積累，抑制菌體生長[20]，從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。隨著酵母蛋白胨質(zhì)量濃度的增加，酶活也逐漸增加，在酵母蛋白胨質(zhì)量濃度為28 g/L時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加酵母蛋白胨質(zhì)量濃度，酶活反而下降。這可能氮源質(zhì)量濃度過高會(huì)導(dǎo)致菌體失水[20]。隨玉米漿質(zhì)量濃度的增加，酶活反而下降。這可能是因?yàn)橛衩诐{質(zhì)量濃度增加時(shí)耗糖速率也隨之增加，副產(chǎn)物也會(huì)增加[24]，不利于產(chǎn)酶。隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加，酶活先增加后減小。這可能是因?yàn)镵H2PO4和K2HPO4的加入可以促進(jìn)菌體生長和外源蛋白的合成，但過高的KH2PO4濃度會(huì)導(dǎo)致菌體衰退[25]。隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，L-ASNase酶活先增大后減小，過高的鹽濃度會(huì)破壞滲透調(diào)節(jié)，對(duì)菌體生長不利[26]。

由預(yù)測(cè)刻畫圖可知，當(dāng)蔗糖為65 g/L、酵母蛋白胨28 g/L、玉米漿11 g/L、KH2PO411.5 g/L、NaCl 3.3 g/L時(shí)，L-ASNase酶活最大預(yù)測(cè)值為517.3 U/mL。為了驗(yàn)證神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，利用此培養(yǎng)基進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，L-ASNase酶活平均值為515.6 U/mL，和預(yù)測(cè)值十分接近，說明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能有效地進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本研究使用單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基中影響酶活的5個(gè)顯著因素分別為：蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl。通過CCD實(shí)驗(yàn)建立數(shù)據(jù)樣本，使用JMP10.0神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)構(gòu)建了5×7×1三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。該模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際值十分接近，能準(zhǔn)確地反映出網(wǎng)絡(luò)輸入元與輸出元之間的映射關(guān)系。最終得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：蔗糖65 g/L、酵母蛋白胨28 g/L、玉米漿11 g/L、KH2PO411.5 g/L、NaCl 3.3 g/L、(NH4)2SO44 g/L、K2HPO4·3H2O 22.5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、L-天冬酰胺2 g/L。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，L-ASNase酶活可達(dá)515.6 U/mL，和優(yōu)化前相比酶活提高了90.9%。本研究的L-ASNase最終產(chǎn)量雖然低于KHUSHOO[12]和SUSHMA[14]報(bào)道的發(fā)酵罐水平產(chǎn)量，但比其搖瓶水平高很多，具有較大的潛在能力，為實(shí)現(xiàn)重組B.subtilis高效生產(chǎn)L-ASNase提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。